WEKTORY WAHADŁOWE ENZYMY W KLONOWANIU POLIMERAZY

Transkrypt

1 WEKTORY WAHADŁOWE Replikują się w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych (również ssaków) Złożone z fragmentów DNA charakterystycznych dla Procaryota i Eukaryota - pierwsza część zawiera ori i marker selekcyjny, - druga- miejsce rozpoczęcia replikacji dla Eukaryota, marker selekcyjny i sekwencje umożliwiające ekspresję genu (insertu) oraz polilinker Są wektorami integracyjnymi- replikacja zależna jest od cyklu życiowego gospodarza (stanowią integralną część genomu) Plazmid 2μ Sztuczny chromosom drożdżowy (1983r) ENZYMY W KLONOWANIU Polimerazy (namnożenie DNA jako klonowanego insertu) Enzymy restrykcyjne (nacięcie wektora lub pofragmentowanie DNA jako klonowanego insertu) Ligazy (połączenie insertu z wektorem) ENZYMY MODYFIKUJĄCE Fosfatazy (usuwają grupę fosforanową z końca 5 ) Kinazy (przenoszą grupę fosforanową z cząsteczki donora na koniec 5 ) POLIMERAZY Do syntezy cząsteczki DNA- polimerazy o bardzo dużej wierności! Przed ligacją- tępienie lepkich końców: polimerazy: Klenowa lub polimeraza T4 1

2 FOSFATAZA ALKALICZNA Hydrolaza o aktywności fosfatazy CIP (Calf Intestine Phosphatase) lub BAP (Bacterial Alcaline Phosphatase) otrzymywana z E. coli lub SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase ) Dimeryczny glikoproteid o masie 69kDa, zawiera 4 atomy cynku i magnezu na cząsteczkę Jest inaktywowana przez czynniki chelatujące, CIP i SAP mogą być dodatkowo inaktywowane podniesieniem temperatury do 68 o C (podczas, gdy BAP jest w tej temperaturze stabilna; ulega degradacji w temperaturze pow.75 o C) Usuwa 5 grupę fosforanową ze wszystkich rodzajów cząsteczek kwasów nukleinowych oraz z dntp i rntp Optymalną aktywność osiąga w zależności od rodzaju defosforylowanych cząsteczek: - CIP- 37 o C RNA, DNA z lepkimi końcami 5 ale 56 o C dla DNA z końcami tępymi i lepkimi 3 - BAP- 45 o C dla RNA ale 65 o C dla wszystkich rodzajów DNA FOSFATAZA ALKALICZNA Defosforylacja wektora- przeciwdziała jego autoligacji, ponieważ liniowa forma wektora, uzyskana działaniem enzymu restrykcyjnego, ma większą zdolność do odtworzenia swojej pierwotnej postaci niż do połączenia się z inną cząsteczką DNA W przypadku, gdy insert i wektor pocięte są tym samym enzymem restrykcyjnym, nie uzyska się polarności końców, aby zwiększyć powinowactwo ligacji- defosforyluje się dodatkowo wektor Niestety defosforylacja wektora może wpływać negatywnie na skuteczność transformacji! Defosforylacja insertu ( bardzo rzadko!) gdy otrzymany jest jako produkt reakcji PCR ze znakowanymi starterami KINAZA POLINUKLEOTYDOWA T4 Pochodzi z E.coli zakażonych fagiem T4 Tetramer identycznych podjednostek o masie 33kDa Aktywność fosfatazy jak u fosfatazy alakalicznejwszechstronna Przenosi gamma fosforan z ATP na koniec 5 -OH Usuwa grupy fosforanowe z końców 3 (ta własność pochodzi z faga T4) Optimum wykazuje w 37 o C Stosowana do FOSFORYLACJI cząsteczek z tępymi końcami 2

3 KINAZA POLINUKLEOTYDOWA T4 TERMINALNA DEOKSYNUKLEOTYDO- TRANSFERAZA TdT Izolowana z trzustki cielęcej Dimer różnej wielkości podjednostek o masie 26 i 80kDa Polimeryzuje nukleotydy na końcach 3 -OH w cząsteczkach jedno- i dwuniciowego DNA zarówno do lepkich, jak i tępych konców oraz rybonukleotydy (z b. małą wydajnością) Tworzy homopolimerowe ogony TERMINALNA DEOKSYNUKLEOTYDO- TRANSFERAZA TdT Insert wektor +dttp 3

4 Inżynieria genetyczna Celowa ingerencja w organizm, polegająca na wprowadzeniu do genomu żywego organizmu nowych informacji genetycznych Przeniesienie genów z jednego organizmu do innego, lub zmodyfikowanie genomu poprzez izolowanie lub eliminację kodu genetycznego W wyniku takich zabiegów organizm ulega modyfikacji, przybierając cechy zgodne z oczekiwaniami; zmianom ulegają: - właściwości fizyczne (np.: rozmiar, masa, wygląd, kolor, itp.) - fizjologiczne (np.: procesów wzrostu i starzenia się, odporności, itp.) Podstawowe pojęcia Transformacja- wprowadzenie do komórki fragmentu DNA innego organizmu Transgen - gen lub materiał genetyczny przeniesiony z komórek jednego organizmu do innego (także z wirusów) Organizm transgeniczny (transformant)= modyfikowany genetycznie (GMO)- organizm (i jego potomstwo) otrzymany po transformacji Klonowanie- tworzenie identycznej kopii komórki, organizmu Indukowana mutageneza- proces kontrolowany mający na celu wprowadzenie zmian (jakościowych) w genomie Konstrukt genowy- różne cząsteczki (fragmenty) DNA będące wynikiem połączenia (ligacji) i służące do doświadczeń 1928 Fryderyk Griffith, odkrywa istnienie czynnika transformacyjnego Streptococcus pneumoniae (dwoinka) wywołujące ostre zapalenie płuc- grypa Hiszpanka Typ IIIS (posiadające kapsułę polisacharydową) oraz IIR (nieposiadające)- oba typy rozpoznawalne w warunkach in vitro 4

5 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty potwierdzają istnienie czynnika transformacyjnego, wyjaśniają co jest podstawą udanej transformacji (nie białka lecz DNA) Przed procesem transformacji do unieszkodliwionych termicznie bakterii wywołujących stan chorobowy dodawano kolejno: - proteazę, lipazę, RNazę, DNazę W trzech pierwszych przypadkach transformacja przebiegała pomyślnie, w ostatnim nie! 1952 Alfred Herschey i Marta Chase transformują bakterie wirusem Bakteriofag T2 posiada tylko białkowy kapsyd i DNA znakowanie izotopowe potwierdza, że przemieszczeniu ulega tylko DNA 1972 Gobin Khorana Paul Berg syntetyzują in vitro trzynukleotydowe cząsteczki DNA, z wykorzystaniem fosfodiestrów 5

6 1973 Herbert Boyer i Stanley Cohen opracowują technikę rekombinacji DNA różnych organizmów (Procaryota i Eukaryota) Konstruują funkcjonalne plazmidy Wprowadzają do genomu bakteryjnego plazmidy z fragmentami genów wirusa lub płaza Pokazują nieograniczone możliwości transformacji! I co było dalej.? Bezpieczna produkcja insuliny, hormonu wzrostu, IX czynnik krzepnięcia krwi na bazie transgenicznych bakterii Produkcja szczepionki na wirusowe zapalenie wątroby typu B Produkcja transgenicznych roślin- złoty ryż Klonowanie- owca Dolly i 264 inne gatunki! Indukowana mutageneza- pozwala sprawdzać funkcje genów Konstrukty genowe- terapia genowa INŻYNIERIA GENETYCZNA NA ŚWIECIE Organizmy GM jako broń biologiczna Organizmy GM jako zanieczyszczenie środowiska i niekontrolowany przepływ genów (zapylenie krzyżowe roślin) Oddziaływanie GMO na ekosystem- udowodnione! Teoria Czerwonej Królowej - szybsze zmiany jednego czynnika wymuszają zmiany na drugim czynniku GMO może nieźle namieszać kanibalizm; weganizm; religia 6