Ćwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

Transkrypt

1 Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Katedra Biologii Molekularnej Biologia i Biologia Medyczna II rok Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ================================================================= Ćwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR - ang. polymerase chain reaction), jest to technika dzięki której możliwe jest otrzymanie dużej liczby kopii określonego fragmentu DNA. Technika ta została opracowana w 1983 przez Kary ego Mullisa, za co w 1993 otrzymał Nagrodę Nobla. W reakcji PCR wykorzystano fakt, że polimeraza DNA zachowuje swoją aktywność in vitro. Oznacza to, że w odpowiednich warunkach, enzym ten zdolny jest do katalizowania reakcji polimeryzacji DNA poza żywym ustrojem. Polimeraza DNA, aby rozpocząć syntezę nowej nici w kierunku 5 3, wymaga wolnych końców 3 DNA; dlatego w reakcji PCR konieczne jest użycie starterów, czyli syntetycznych oligonukleotydów o określonej sekwencji nukleotydowej. Startery projektuje się w taki sposób, aby przyłączały się do matrycowej nici DNA w rejonach flankujących fragment, który planujemy powielać (amplifikować). Reakcja prowadzona jest w termocyklerze urządzeniu, które umożliwia obniżanie i podwyższanie temperatury, w zależności od etapu cyklu. Każdy cykl reakcji PCR składa się z trzech etapów: (1) denaturacji DNA, (2) hybrydyzacji starterów i matrycowych nici DNA oraz (3) elongacji starterów (ryc. 1). W pierwszym etapie reakcji, pod wpływem wysokiej temperatury (ok. 95 C) dochodzi do denaturacji DNA, czyli zerwania wiązań wodorowych pomiędzy nićmi DNA. Następnie temperatura mieszaniny reakcyjnej zostaje obniżona w taki sposób, aby możliwe było przyłączenie poprzez wiązania wodorowe (hybrydyzacja) starterów do komplementarnych rejonów matrycowej nici DNA. Optymalna dla tego etapu reakcji temperatura zależy od sekwencji nukleotydowej starterów i ich długości (w praktyce stosuje się zwykle temperaturę o 5 stopni niższą niż temperatura topnienia starterów). Ostatnim etapem reakcji jest wydłużanie (elongacja) starterów przyłączonych do nici matrycowych, czyli polimeryzacja DNA w temperaturze optymalnej dla użytego enzymu (zależnej od rodzaju polimerazy). Na tym etapie polimeraza DNA katalizuje tworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcami 3 starterów a końcem 5 odpowiednich deoksyrybonukleotydów. Zwykle taki cykl reakcji powtarzany jest od 25 do 45 razy. Rycina 1. Schemat przebiegu reakcji PCR. Kolorem czarnym oznaczono DNA matrycowy, różowym startery, kolorem niebieskim nowo syntetyzowaną nić DNA. 1

2 W każdym cyklu z jednej cząsteczki matrycowego DNA powstają dwie cząsteczki DNA nowo zsyntetyzowanego (ryc. 2), można zatem powiedzieć, że ilość DNA w reakcji wzrasta w przybliżeniu w tempie 2 n, gdzie n oznacza numer cyklu. DNA będący produktem każdego cyklu, służy jako matryca w następnych cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększenie puli syntetyzowanego DNA, aż do momentu wyczerpania substratów do syntezy (np. starterów) lub nagromadzenia produktów ubocznych reakcji hamujących aktywność polimerazy DNA. Rycina 2. Schemat przedstawiający przyrost DNA w reakcji PCR. Gwiazdką oznaczono docelowy produkt reakcji. Mieszanina reakcyjna zawiera następujące składniki: 1. Matrycowy DNA, czyli dwuniciowa cząsteczka DNA, której fragment stanowi powielaną matrycę 2. Para starterów (nazywanych też primerami), czyli chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy o długości ok par zasad, których sekwencja nukleotydowa jest komplementarna do miejsc flankujących powielany rejon matrycowego DNA 3. Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) 4. Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji (właściwe ph, odpowiednie stężenie jonów Mg 2+, odpowiednia siła jonowa) 1. Matrycowy DNA Optymalna dla reakcji PCR ilość matrycowego DNA zależy od jego wielkości i może się wahać w granicach od kilku pg (dla plazmidowego lub wirusowego DNA) do kilkudziesięciu µg (dla DNA genomowego wyższych organizmów). DNA używane w reakcji PCR powinno być wolne od substancji mogących hamować reakcję PCR, np. EDTA/EGTA. 2. Startery Dobrze zaprojektowana para starterów charakteryzuje się następującymi cechami: - oba zawierają ok. 50% par GC, - nie tworzą struktur typu spinki do włosów (ang. hairpin loop), - nie zawierją fragmentów komplementarnych do drugiego startera, - ich temperatury topnienia (ang. melting temperature Tm) różnią się nie więcej niż o 2 C i wynoszą ok o C. Temperatura topnienia jest parametrem opisującym dowolny fragment DNA, w tym także startery; jest to taka temperatura, przy której 50% danego DNA w roztworze wodnym ulega denaturacji. Wartość Tm zależy w przybliżeniu wprost proporcjonalnie od długości DNA oraz ilości par G:C w danym DNA. 3. Termostabilna polimeraza DNA. Termostabilne polimerazy nie tracą aktywności w temperaturze wymaganej do denaturacji DNA. Jedną z najczęściej obecnie stosowanych polimeraz jest termostabilna polimeraza DNA wyizolowana 2

3 z termofilnej bakterii Thermus aquaticus (Taq polimeraza). Innym przykładem często stosowanej polimerazy może być termostabilna polimeraza izolowana z termofilnego archeona Pyrococcus furiosus (polimeraza Pfu), odznaczająca się większą niż Taq wiernością kopiowania. W zależności od użytej polimerazy, DNA będący produktem reakcji PCR może mieć tępe końce (Pfu) lub wiszące sekwencje adenin na końcu 3 (tzw. ogony poly-a dodawane np. przez polimerazę Taq). 4. Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp) Trójfosforany deoksyrybonukleotydów stanowią jeden z głównych substratów reakcji (są budulcem dla nowo powstających nici DNA). Stężenie każdego z dntp w mieszaninie reakcyjnej (datp, dctp, dgtp, dttp) powinno wynosić ok. 200 µm; zbyt wysoka ilość dntp może hamować reakcję PCR. 5. Bufor reakcyjny Bufor reakcyjny jest mieszaniną związków chemicznych warunkujących utrzymanie optymalnego dla użytej polimerazy ph oraz stężenia jonów. Szczególne znaczenie ma zawartość soli MgCl 2 i MgSO 4, ponieważ jony Mg 2+ są kofaktorami polimeraz DNA. Zbyt niskie stężenie jonów Mg 2+ może skutkować niską wydajnością polimeryzacji DNA, jednak nadmiar wolnych jonów Mg 2+ może spowodować powstawanie niespecyficznych produktów, ponadto kompleksy jonów Mg 2+ z wolnymi dntp mogą hamować aktywność polimerazy. Modyfikacje techniki PCR o różnych zastosowaniach PCR RFLP (ang. polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism) jest techniką, w której po namnożeniu odpowiedniego fragmentu DNA (np. genu, którego mutacja wywołuje chorobę), trawi się produkt reakcji za pomocą enzymów restrykcyjnych, a następnie rozdziela trawiony DNA elektroforetycznie. Enzymy restrykcyjne to białka, które rozpoznają, a następnie przecinają specyficzną sekwencję DNA; jeśli w obrębie takiej sekwencji nastąpi zmiana (mutacja) - miejsce rozpoznawane przez dany enzym restrykcyjny zniknie i uwidoczni się to we wzorze prążków, powstałych po rozdziale elektroforetycznym produktów reakcji PCR RFLP. Może się również zdarzyć, że w skutek mutacji powstaną nowe miejsca restrykcyjne, co również można uwidocznić za pomocą tej metody. PCR-RFLP ma zastosowanie w diagnostyce molekularnej pozwala np. odkryć niektóre mutacje w interesującej nas sekwencji DNA. Technika RT PCR (ang. reverse transcription polymerase chain reaction) umożliwia z kolei syntezę DNA na matrycy RNA. W metodzie tej wykorzystywany jest enzym, odwrotna transkryptaza, który umożliwia przepisanie badanej sekwencji RNA na DNA. Tak otrzymany odcinek określa się jako cdna (ang. complementary DNA). cdna zostaje następnie powielony tak jak podczas standardowej reakcji PCR. Technika RT PCR jest szczególnie przydatna w diagnostyce chorób wirusowych gdyż wiele wirusów ma genomy zbudowane z RNA. Metoda ta umożliwia również określenie sekwencji kodującej genów organizmów eukariotycznych (sekwencji exonów). Skrót RT PCR jest niekiedy używany także w odniesieniu do innej techniki Real Time PCR ( PCR w czasie rzeczywistym). W tym przypadku jest to nieścisłość poprawny skrót nazwy tej techniki to qpcr, z ang. quantitative PCR - ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy DNA. qpcr to metoda pozwalająca uzyskać dane o ilości badanego DNA (lub RNA, jeśli połączy się ją z techniką RT-PCR opisaną powyżej metoda nazywana jest wtedy qrt-pcr). Jest to możliwe dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych, które reagują zmianami w intensywności emitowanego światła w zależności od ilości produktu w mieszaninie reakcyjnej. 3

4 Analiza restrykcyjna DNA Enzymy restrykcyjne (restryktazy) to białka z grupy endonukleaz, które wiążą specyficzne sekwencje nukleotydowe i katalizują hydrolizę wiązania fosfodiestrowego w określonych miejscach łańcucha DNA. Restryktazy występują powszechnie w komórkach archeonów i bakterii, gdzie stanowią część tzw. systemów restrykcyjno-modyfikacyjnych, zabezpieczających te organizmy przed infekcją wirusową. Systemy te składają się najczęściej z pary białek: restryktazy i metylazy. Metylaza jest enzymem katalizującym przeniesienie grupy metylowej na zasadę azotową określonego nukleotydu będącego częścią sekwencji DNA rozpoznawanej przez odpowiednią restryktazę. Obecność grup metylowych w określonych miejscach sekwencji DNA uniemożliwia wiązanie danej restryktazy, chroniąc w ten sposób DNA gospodarza przed degradacją, podczas gdy DNA wirusowy (niemetylowany) ulega fragmentacji (ryc. 3). A B Rycina 3. Schemat obrazujący działanie systemów restrykcyjno-modyfikacyjnych. Kolorem różowym oznaczono restryktazę rozpoznającą sekwencję GATC. W tym przypadku restryktaza katalizuje hydrolizę wiązania fosfodiestrowego pomiędzy nukleotydami A oraz G (panel A). Przyłączenie przez odpowiednią metylazę grup metylowych do adeniny w sekwencji GATC zapobiega wiązaniu do tej sekwencji restryktazy i degradacji DNA (panel B). Nazwy enzymów restrykcyjnych tworzone są na podstawie nazwy mikroorganizmu, z którego dany enzym pochodzi. Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, druga i trzecia gatunek, a kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii, np.: EcoRI oznacza enzym wyizolowany ze szczepu R Escherichia coli, Hind III enzym wyizolowany ze szczepu Hemophilus influenzae serotyp d. Obecne w nazwach niektórych restryktaz liczby rzymskie wynikają z chronologii izolowania enzymów z tych samych mikroorganizmów (np. HindIII był historycznie trzecim enzymem restrykcyjnym wyizolowanym z Hemophilus influenzae serotyp d, zaś EcoRI pierwszym z enzymów wyizolowanych ze szczepu R Escherichia coli). Poznane dotychczas enzymy restrykcyjne, na podstawie różnic w mechanizmie trawienia DNA, rodzaju kofaktora, rodzaju substratu oraz produktu katalizowanej reakcji, pogrupowano w trzy klasy. Klasa I obejmuje białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i jonów Mg 2+. Enzymy należące do tej klasy posiadają następujące cechy: działają zarówno jako restryktazy, jak i jako kodyfikacyjne metylazy substratem dla tej klasy enzymów jest dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję długości kilkunastu nukleotydów enzymy te nacinają obie nici DNA w rejonie znajdującym się w określonej odległości od rozpoznawanej sekwencji. Oznacza to, że specyficzna jest jedynie sekwencja DNA wiążąca enzym, natomiast sekwencja, w rejonie której DNA jest nacinany jest zmienna. W Klasie II zgrupowano białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane przez jony Mg 2+. Enzymy należące do tej klasy posiadają następujące cechy: substratem dla nich jest dwuniciowy DNA zawierający kilku-nukleotydową sekwencję specyficznie rozpoznawaną przez dany enzym cięcie obu nici zachodzi w obrębie rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS) większość enzymów należących do tej klasy rozpoznaje sekwencje palindromowe (posiadające oś symetrii) o długości czterech, sześciu lub ośmiu nukleotydów. 4

5 Klasa III obejmuje enzymy aktywowane przez jony Mg 2+ i ATP, czasem do reakcji konieczna jest też S-adenylometionina. Endonukleazy restrykcyjne klasy III: rozpoznają niesymetryczną sekwencję DNA, np.: AGACC EcoPI; CAGCAG EcoP15I; CGAAT HinfIII; CAGAG Styli przecinają cząsteczkę DNA w odległości pz na prawo od rozpoznawanej sekwencji. Wśród pojęć związanych z enzymami restrykcyjnymi można spotkać sformułowania takie jak izoschizomer oraz neoschizomer. Izoschizomery to enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia. Neoschizomerami nazywamy natomiast enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. Wydaje się, że przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie, lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych, ponieważ stosując odpowiednio niskie stężenie enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki o przeciętej tylko jednej z nici. W zależności od użytego enzymu restrykcyjnego obie nici DNA mogą być trawione w różny sposób dając w konsekwencji dwa rodzaje końców fragmentów DNA: 1) w tym samym miejscu, jak np. w przypadku trawienia DNA enzymem SmaI 5` CCCGGG 3` 5` CCC GGG 3` 3` GGGCCC 5` 3` GGG CCC 5` Powstające w wyniku takiej reakcji fragmenty DNA posiadają tzw. tępe końce. 2) w miejscach przesuniętych o kilka nukleotydów, np. w przypadku enzymu EcoRI: 5` GAATTC 3` 5` G AATTC 3` 3` CTTAAG 5` 3` CTTAA G 5` W wyniku takiej reakcji powstają fragmenty DNA zawierające tzw. lepkie końce, w których jedna z nici jest o kilka nukleotydów dłuższa od drugiej odpowiednio na końcu 3 lub 5. W sekwencji nukleotydowej danej cząsteczki DNA znajdują się miejsca rozpoznawane przez określony zbiór enzymów restrykcyjnych. Wzajemne ułożenie tych miejsc to mapa restrykcyjna. Produkty trawienia enzymami restrykcyjnymi analizuje się zwykle poprzez rozdział elektroforetyczny w żelach agarozowych. Rozdzielone fragmenty DNA uwidacznia się stosując odpowiednie fluorochromy (barwniki wiążące DNA, które emitują światło najczęściej po wzbudzeniu światłem UV np. bromek etydyny). Wielkość uzyskanych po trawieniu fragmentów określa poprzez porównanie z DNA wzorcowym (tzw. markerem DNA). Wzór uzyskiwany po rozdziale elektroforetycznym danej cząsteczki DNA trawionej wybranymi enzymami to tzw. wzór restrykcyjny. Każda cząsteczka DNA ma określoną mapę i wzór restrykcyjny. Wielkość fragmentów DNA, które powstaną po zastosowaniu danego enzymu do trawienia dużych cząsteczek DNA można oszacować na podstawie długości sekwencji rozpoznawanej przez ten enzym, stosując wzór: L k = 4 n, gdzie L k oznacza liczbę możliwych kombinacji n-nukleotydowych, n oznacza liczbę nukleotydów w sekwencji rozpoznawanej przez dany enzym. Na przykład enzym rozpoznający sekwencje sześcio-nukleotydowe tnie DNA na relatywnie duże fragmenty, ponieważ dana sekwencja występuje średnio raz na 4096 zasad (4 6, ponieważ DNA zawiera kombinacje 4 różnych nukleotydów, zaś enzym rozpoznaje tylko jedną z możliwych sześcio-nukleotydowych kombinacji). Natomiast używając enzymu rozpoznającego cztero-nukleotydowe sekwencje DNA, cząsteczka będzie cięta średnio raz na 256 nukleotydów (4 4 ), otrzymamy zatem znacznie mniejsze fragmenty DNA. 5

6 Zawartość enzymów w roztworze określa się w tzw. jednostkach aktywności (ang. activity units U). Jedna jednostka aktywności (1U) dowolnego enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która kompletnie trawi 1 µg DNA wzorcowego (np. fag λ) w czasie 1 godziny w temperaturze optymalnej dla tego enzymu. Niektóre enzymy restrykcyjne, w pewnych warunkach mogą przejawiać aktywność niespecyficzną (tzw. star activity). Zjawisko star activity polega na utracie specyficzności enzymu (np. enzym tnie DNA w rejonach, które nie zawierają charakterystycznej sekwencji, zwykle rozpoznawanej przez ten enzym). Efekt star activity pojawia się w przypadku, gdy warunki reakcji znacznie różnią się od optymalnych, np. W obecności wysokiego stężenia glicerolu w mieszaninie reakcyjnej (>5% obj.) Przy zastosowaniu do reakcji zbyt wysokiego stężenie enzymu w stosunku do stężeniach DNA Podczas trawienia w nieodpowiednim buforze reakcyjnym (o zasadowym ph; o zbyt wysokiej zawartości jonów) Znacznie wydłużony czas reakcji enzymatycznej W obecności niektórych związków organicznych (np. DMSO, etanol, glikol etylenowy) Jeśli w mieszaninie reakcyjnej zastąpiono (lub znacznie zwiększono koncentrację) jonów magnezu innymi biwaletnymi jonami (Mn 2+, Cu 2+, Co 2+ lub Zn 2+ ) Różnorodność sekwencji rozpoznawanych przez białka systemów restrykcyjno-modyfikacyjnych sprawia, że enzymy te znalazły szerokie zastosowanie w inżynierii genetycznej i biotechnologii. Właściwości różnych enzymów restrykcyjnych umożliwiają np. tworzenie fizycznych map DNA, izolację i identyfikację genów oraz są wykorzystywane w diagnostyce molekularnej (np. RFLP). W technice klonowania molekularnego najczęściej wykorzystuje się enzymy restrykcyjne klasy II, jednak poza enzymami restrykcyjnymi zastosowanie w tej metodzie mają także inne enzymy, np. takie które umożliwiają modyfikację końców DNA, w celu uzyskania optymalnych fragmentów DNA; do takich enzymów należą: Ligaza DNA, która umożliwia m.in. dołączenie do zakończonych na tępo fragmentów DNA adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko, o sekwencji specyficznej dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne, zakończonych na tępo ); przed dołączeniem tych ostatnich przeprowadza się metylację genomowego DNA odpowiednią metylazą, zaś po ligacji trawienie DNA daną restryktazą, uzyskując w ten sposób fragmenty DNA zawierające zaplanowane lepkie końce fragment Klenowa polimerazy I DNA E. coli, służący do wypełniania końców fragmentów DNA, w których 5` końce nici są dłuższe niż końce 3 (tworzenie końców tępych z końców lepkich ) nukleaza S1 lub polimeraza I E. coli wykorzystując ich aktywność egzonukleolityczną 3` 5` można usunąć nawisy na końcu 5` Część praktyczna UWAGA! Podczas pracy nie wolno dopuścić do zanieczyszczenia próbek, dlatego wszystkie czynności laboratoryjne należy wykonywać w rękawiczkach jednorazowych (jeżeli rękawiczki w między czasie zostaną zabrudzone, należy je natychmiast zmienić na nowe). Kolejność dodawania poszczególnych składników jest istotna! Probówka podczas dodawania poszczególnych składników powinna znajdować się w łaźni lodowej. 1. Przygotowanie mieszaniny do reakcji PCR Jako matrycę do reakcji wykorzystamy fragment plazmidu pcb104 zawierający gen λo (po ligacji z wektorem puc19 fragment ten przerwie ciągłość gen lacz, tym samym uniemożliwiając biosyntezę aktywnej β- galaktozydazy). Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 μl. 6

7 Roztwór Początkowy Objętość na 1 próbkę Stężenie końcowe Bufor (10x) 2,5 μl (1x) mieszanina dntp (10mM) 0,5 μl (200µM) primer Forvard (10µM) 0,25 μl (0,1µM) primer Revers (10µM) 0,25 μl (0,1µM) matrycowy DNA 1 μl polimeraza DNA (5U/µl) 0,1 μl woda destylowana dopełnić do 25 μl 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) Program reakcji PCR: 1 denaturacja wstępna 95 o C, 5 min Cykl PCR: 2 denaturacja 95 o C, 30 sekund 3 przyłączenie primera... o C, 30 sekund 4 wydłużanie 72 o C, 30 sekund 6 końcowe wydłużanie 72 o C, 5 min 30 cykli 3. Trawienie restrykcyjne wektora PUC19 enzymami BamHI oraz PstI BamHI 5 --G GATCC CCTAG G 5 PstI 5'--CTGCA G--3' 3'--G ACGTC 5' Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20 μl: 1 μl BamHI (FastDigest) 1 μl PstI (FastDigest) 2 bufor (10X FastDigest Green Buffer) 2 μl DNA plazmidowego 15 ul wody Delikatnie wymieszać, krótko zwirować. Trawienie w 37 o C przez 5 minut inaktywacja 5 min 80 o C 4. Analiza produktu amplifikacji 1. Przygotować agarozę 1% w buforze 0.5x TAE 2. Wylać żel w odpowiednim aparacie, poczekać do zastygnięcia agarozy 3. Do komór aparatu nalać bufor 0.5x TAE, tak aby pokrywał on powierzchnię żelu 4. Do studzienek żelu nanieść próbki DNA po 10 μl z każdej reakcji PCR zmieszane z buforem obciążającym w proporcji 5:1 5. Rozdział prowadzić przy stałym napięciu 5V/cm długości żelu 6. Żel barwić w roztworze bromku etydyny i oglądać w świetle ultrafioletowym. Zagadnienia do samodzielnego opracowania: 1. Budowa kwasów nukleinowych. 2. Typy PCR. 3. Zastosowanie technik PCR. 4. Enzymy restrykcyjne (klasy, nazewnictwo, zastosowanie). Literatura: 1. Sęktas M. Zastosowanie inżynierii genetycznej w biotechnologii. Molekularne podstawy ekspresji genów 2. P.C.Turner, A.G. McLennan i inni Biologia molekularna krótkie wykłady 7