TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS

Transkrypt

1 Nowiny Lekarskie 2006, 75, 5, ALINA LICZBAŃSKA, ANNA WOŹNIAK, ANNA WAWROCKA, MACIEJ R. KRAWCZYŃSKI TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. med. Anna Latos-Bieleńska Streszczenie W przeszłości diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie opierała się na rozpoznaniu klinicznym i biochemicznym. Dziś, dzięki olbrzymiemu postępowi, jaki dokonał się w genetyce i biologii molekularnej można diagnozować choroby genetyczne na poziomie nieprawidłowego genu. Wyrosła na tym podłożu diagnostyka molekularna dysponuje dwoma narzędziami diagnostycznymi: technikami hybrydyzacyjnymi oraz łańcuchową reakcją polimerazy i jej modyfikacjami. Bezpośrednia diagnostyka molekularna chorób jednogenowych stała się wysokospecjalistyczną dziedziną nauki, której ostateczny wynik daje obraz sekwencji analizowanego fragmentu genu. SŁOWA KLUCZOWE: DNA, mutacje, diagnostyka molekularna, choroby jednogenowe. Summary In the past, the diagnostics of genetic diseases was based on clinical and biochemical investigation. Today, recent huge progress in genetics and molecular biology have made possible to diagnose genetic disorders at the level of abnormal gene. In that way molecular diagnostics became a part of diagnostic procedures. There are two types of molecular diagnostics: hybridization of examined gene fragment with a molecular probe and polymerase chain reaction with gel electrophoresis. The most important direct DNA analysis in monogenic diseases is DNA sequencing, which can characterize the type of mutation in a given gene. KEY WORDS: DNA, mutations, molecular diagnostics, monogenic diseases. Wstęp Choroby genetyczne definiuje się jako upośledzające sprawność życiową odchylenia od stanu prawidłowego, które są przekazywane jako cecha dziedziczna z pokolenia na pokolenie, bądź, które powstają de novo na skutek mutacji genowych lub zaburzeń w mechanizmach przekazywania cech dziedzicznych. Choroby genetyczne populacji ludzkiej można podzielić na: jednogenowe, wielogenowe oraz chromosomalne. W przypadku aberracji chromosomowych zmiany materiału genetycznego są duże i można je analizować w mikroskopie świetlnym metodami cytogenetycznymi. W chorobach wielogenowych wiele par genów stwarza predyspozycję do wystąpienia choroby, chociaż istotny jest również wpływ szkodliwych czynników środowiskowych [1]. Choroby jednogenowe, przekazywane zgodnie z prawami Mendla są uwarunkowane zmianą sekwencji (mutacją) w obrębie jednego genu. Zaliczamy do nich choroby autosomalne recesywne (np. mukowiscydoza, fenyloketonuria, anemia sierpowata), autosomalne dominujące (np. choroba Huntingtona) oraz sprzężone z płcią (np. hemofilia, dystrofia mięśniowa Duchenne a) [2]. Zmiany materiału genetycznego w chorobach jednogenowych są submikroskopowe i mogą być analizowane jedynie metodami biologii molekularnej [3]. Przyczyną chorób uwarunkowanych jednogenowo mogą być zarówno mutacje punktowe obejmujące zmiany pojedynczych zasad, jak i większe mutacje, które dotyczą dłuższych zmian w sekwencji DNA. Wyróżnia się kilka kategorii mutacji punktowych. Mutacje zmiany sensu zmieniają kodon określonego aminokwasu, czego efektem jest jego zamiana na inny aminokwas. Mutacje nonsensowne polegają na zamianie kodonu aminokwasowego na kodon stop, w skutek czego dochodzi do przedwczesnego zakończenia translacji i wytworzenia skróconej formy białka. Mutacje zmiany fazy odczytu są wynikiem insercji lub delecji kilku par zasad (ale nie 3 i ich wielokrotności). W rezultacie, od miejsca mutacji do końca genu odczytywane są zupełnie inne zestawy kodonów, co w efekcie prowadzi do powstania białka o znacznie zmienionej sekwencji aminokwasowej. Mutacje punktowe mogą dotyczyć miejsc regulatorowych genu (mutacje transkrypcyjne), procesu translacji (mutacje translacyjne) oraz miejsc splicingowych (mutacje RNA). Pozostałe mutacje różnią się od punktowych rozmiarami i mogą polegać na utracie/zwielokrotnieniu odcinka DNA lub całego genu (delecja/duplikacja) lub wstawieniu dodatkowych par zasad (insercja). Do zmian zalicza się również tzw. mutacje dynamiczne, które polegają na zwielokrotnieniu liczby powtórzeń trójnukleotydowego motywu [4]. Większość z wymienionych wyżej mutacji wywiera znaczny wpływ na strukturę i funkcję białka kodowanego przez zmutowany gen, co w efekcie rzutuje na postać choroby. Jednym z najważniejszych zagadnień współczesnej medycyny jest problem wczesnej diagnostyki chorób

2 Techniki wykorzystywane w diagnostyce molekularnej chorób jednogenowych 487 genetycznych. Dotyczy on przede wszystkim pediatrii, gdyż ogromna większość, bo blisko 90% chorób jednogenowych, ujawnia się klinicznie przed okresem dojrzewania płciowego [2]. Przed wprowadzeniem badań molekularnych diagnostyka chorób genetycznych opierała się przede wszystkim na badaniach cytogenetycznych, a w przypadku chorób metabolicznych na oznaczaniu aktywności enzymów, których niedobór warunkował te choroby. W praktyce oznaczało to możliwość diagnostyki biochemicznej tylko tych chorób genetycznych, w których znany był produkt danego genu [5]. Obserwowany od połowy lat siedemdziesiątych szybki rozwój biologii molekularnej przyczynił się do lepszego zrozumienia chorób uwarunkowanych genetycznie. Wśród najważniejszych osiągnięć w badaniach DNA, które umożliwiły szybki rozwój badań molekularnych należy wymienić rozwiązanie struktury DNA w 1953 roku przez Watsona i Cricka, odkrycie enzymów restrykcyjnych w 1962 roku, które umożliwiły opracowanie w późniejszym czasie metod klonowania DNA, transfer DNA metodą Southerna oraz sekwencjonowanie DNA. Jednak z pewnością najważniejszym osiągnięciem w genetyce i biologii molekularnej ostatniego wieku było opracowanie w 1987 roku przez Mullisa, zasad amplifikacji wybranych fragmentów DNA metodą PCR, za które w 1993 roku otrzymał Nagrodę Nobla [2]. Na bazie wymienionych badań i odkryć narodziła się diagnostyka molekularna chorób genetycznych, której historia sięga lat siedemdziesiątych i badań nad anemią sierpowatą. Do wykrywania mutacji w kodonie 6 β-globiny zastosowano wówczas analizę restrykcyjną DNA i hybrydyzację z sondą molekularną [6]. Obecnie jest ona jednym z najszybciej rozwijających się działów biologii i medycyny. Diagnostykę molekularną można podzielić na dwa typy: diagnostykę bezpośrednią oraz pośrednią. Diagnostyka bezpośrednia służy wykrywaniu mutacji w genach sklonowanych i zmapowanych, natomiast pośrednia przebiega z zastosowaniem analizy sprzężeń i jest stosowana rzadziej [3]. Metody biologii molekularnej stosowane w diagnostyce chorób genetycznych można zasadniczo podzielić na dwie grupy: metody oparte na hybrydyzacji DNA z sondami molekularnymi oraz metody oparte na reakcji PCR. Diagnostyka oparta na hybrydyzacji z sondami molekularnymi W latach osiemdziesiątych hybrydyzacja badanego materiału genetycznego z sondami molekularnymi stanowiła podstawową metodę badań w diagnostyce chorób genetycznie uwarunkowanych. Hybrydyzacja jest metodą, która umożliwia identyfikację oraz lokalizację określonych sekwencji nukleotydowych. W tym celu wykorzystuje się naturalną zdolność jednoniciowych, znakowanych cząsteczek kwasów nukleinowych (sond molekularnych) do specyficznego wiązania się z komplementarnymi sekwencjami obecnymi w badanym materiale genetycznym. Istotą procesu hybrydyzacji jest wzajemne oddziaływanie pomiędzy fragmentem kwasu nukleinowego a sondą, które prowadzi do utworzenia hybrydu (dupleksu) [6]. Sondami molekularnymi stosowanymi w badaniach hybrydyzacyjnych są oligonukleotydy komplementarne do sekwencji, którą zamierzamy analizować [7]. Przed hybrydyzacją sonda musi być poddana denaturacji oraz znakowaniu. Sondy można znakować radioaktywnie za pomocą takich radioizotopów, jak: 32 P, 35 S, 14 C lub 3 H [6]. Powstałe po reakcji hybrydy wykrywa się wówczas za pomocą autoradiografii na kliszy rentgenowskiej. Jednak ryzyko związane z użyciem radioaktywności doprowadziło do opracowania metod znakowania nieradioaktywnego. Powszechnie stosowany system znakowania sond wykorzystuje nukleotydy związane z ligandami, które na etapie detekcji rozpoznawane są swoistymi przeciwciałami. Proces hybrydyzacji przebiega w kilku etapach. Pierwszym z etapów jest izolacja materiału genetycznego, który potem rozdzielany jest w żelu elektroforetycznym. Następnie jest on denaturowany i przenoszony na filtr nylonowy lub nitrocelulozowy. W kolejnym etapie badany materiał jest poddawany hybrydyzacji z wyznakowaną sondą molekularną. Łączenie się sondy z docelowym fragmentem kwasu nukleinowego jest w odpowiednich warunkach wysoce specyficzne i zachodzi zgodnie z regułą komplementarności zasad [8]. Po odpłukaniu nie związanej sondy możliwe jest wykrywanie powstałych hybrydów poprzez autoradiografię (znakowanie radioaktywne) lub reakcje immunochemiczne, kolorymetrię czy chemiluminescencję (znakowanie nieradioaktywne). Istnieje wiele technik hybrydyzacyjnych, z których część jest wykorzystywana w diagnostyce molekularnej chorób jednogenowych. Hybrydyzacja typu Southern blot (ang. Southern blot hybridisation) jest metodą opisaną w 1975 roku przez Eda Southerna z Uniwersytetu w Oksfordzie. Jest to hybrydyzacja typu DNA-DNA, której głównym celem jest identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie fragmentów otrzymanych po trawieniu restrykcyjnym. W metodzie tej badany DNA izoluje się z komórek, a następnie trawi enzymem restrykcyjnym, który przecina cząsteczkę kwasu nukleinowego w obrębie specyficznej sekwencji. W wyniku trawienia genomowego DNA otrzymuje się tysiące fragmentów, które poddaje się elektroforezie w żelu. Następnie, rozdzielony DNA denaturowany jest w środowisku alkalicznym. Kolejnym etapem jest przeniesienie zdenaturowanego DNA z żelu na stałe podłoże. DNA unieruchomiony na filtrze jest następnie poddawany hybrydyzacji z sondą molekularną. Po odpłukaniu nie związanej sondy przeprowadza się detekcję powstałych hybrydów. W metodzie Southerna uzyskuje się informację o obecności i wielkości poszukiwanego fragmentu DNA. Hybrydyzacja tego typu może być wykorzystywana do wykrywania mutacji o charakterze delecji lub insercji większych niż pz. Długość fragmentów DNA otrzymanych po działaniu enzymu restrykcyjnego określa się na podstawie rozdziału elektroforetycznego w żelach agarozo-

3 488 Alina Liczbańska i inni wych, w obecności markerów wielkości. Ponadto, może być zastosowana do wykrywania mutacji punktowych, które powodują utratę bądź wprowadzenie dodatkowego miejsca restrykcyjnego [4]. Hybrydyzację typu Northern (ang. Northern blot) wykorzystuje się w badaniu poziomu ekspresji poszukiwanego genu. Jest ona podobna do metody Southerna, ale stosuje się ją do analizy typu RNA-DNA. W technice Northern z tkanek izoluje się całkowite RNA, którego główną frakcję stanowi informacyjny RNA (mrna) stanowiący transkrypt genów aktywnych w danym typie komórek. Wyizolowane mrna poddaje się elektroforezie w żelach, denaturuje i przenosi na stały nośnik, a następnie poddaje hybrydyzacji z wyznakowaną sondą DNA. Powstałe hybrydy RNA-DNA wykrywa się za pomocą autoradiografii lub poprzez reakcje immunochemiczne. Obraz otrzymanych po hybrydyzacji dupleksów i ich intensywność dostarcza ważnych informacji o zmianie wielkości transkryptu genu oraz poziomie jego ekspresji [9]. Hybrydyzacja in situ różni się od pozostałych metod hybrydyzacyjnych tym, że stosuje się do wykrywania sekwencji kwasów nukleinowych w nienaruszonych komórkach. Metoda ta jest szeroko stosowana do wykrywania specyficznych sekwencji w preparatach histologicznych, chromosomach, pojedynczych komórkach lub skrawkach tkanek [6]. Hybrydyzacja in situ wykonywana jest bezpośrednio na preparacie mikroskopowym bez uprzedniego etapu izolacji, rozdziału oraz transferu kwasu nukleinowego na podłoże stałe. Jest to metoda, która umożliwia wykrycie i określenie lokalizacji poszukiwanych sekwencji. Wykorzystuje się ją do wykrywania większych mutacji genowych obejmujących duplikację czy delecję genu oraz do identyfikacji specyficznych mrna występujących w poszczególnych komórkach i tkankach [8]. Diagnostyka oparta na amplifikacji DNA metodą PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR polymerase chain reaction) jest potężną i szeroko stosowaną techniką, która w sposób znaczący zmieniła możliwości analizy genów. Opracowana w 1987 r. przez zespół Mullisa stała się w ciągu następnych kilku lat podstawową techniką badawczą i diagnostyczną. Reakcja PCR oparta jest na amplifikacji (powieleniu) in vitro wybranych odcinków DNA lub RNA. Genomowy DNA znajdujący się w komórkach zawiera tysiące genów, co bardzo utrudnia analizę pojedynczych alleli. PCR pozwala na kopiowanie specyficznej sekwencji z genomowego DNA, która następnie może posłużyć do dalszej analizy i manipulacji. Jednym z warunków przeprowadzenia reakcji jest znajomość sekwencji DNA na obu końcach regionu, który ma być amplifikowany. Każda reakcja PCR wymaga czterech podstawowych składników: matrycy DNA, starterów, polimerazy DNA oraz trifosforanów deoksyrybonukleotydów. Matryca to cząsteczka DNA zawierająca sekwencję, która ma ulec namnożeniu. Reakcja PCR wymaga również pary starterów oligonukleotydowych zdolnych do hybrydyzacji z sekwencjami oskrzydlającymi, znajdującymi się na przeciwnych końcach docelowego DNA. Do przeprowadzenia reakcji konieczna jest także obecność enzymu, termostabilnej polimerazy DNA, której rola polega na namnażaniu kopii cząsteczek DNA. Z kolei, trifosforany deoksyrybonukleotydów odpowiadają czterem zasadom azotowym, z których zbudowany jest DNA i są substratami do syntezy nowego DNA [9]. Reakcja PCR składa się z trzech zasadniczych etapów, które tworzą pojedynczy cykl: denaturacji matrycy, hybrydyzacji starterów z matrycą oraz syntezy nici potomnych. Podczas denaturacji w wysokiej temperaturze (94 C 98 C) dwuniciowa helisa DNA ulega destabilizacji i rozdzieleniu na dwie pojedyncze nici. Następnie, po obniżeniu temperatury do 55 C 65 C jednoniciowe startery hybrydyzują ze zdenaturowaną matrycą. Ostatnim etapem jest elongacja, czyli wydłużanie starterów dzięki dobudowywaniu kolejnych nukleotydów przez polimerazę DNA komplementarnie do matrycy, w temperaturze 72 C. Reakcja PCR składa się zwykle z 30 powtarzających się cykli i przeprowadzana jest w urządzeniu zwanym termocyklerem. Metoda PCR pozwala na zwielokrotnienie (nawet miliardkrotne) niewielkich ilości DNA dzięki temu, że powstające produkty służą jako matryce w następnych cyklach [2]. Głównymi zaletami metody PCR są: wysoka czułość (ilość DNA potrzebna do reakcji wynosi poniżej 1 µg), specyficzność oraz szybkość, gdyż wynik reakcji można otrzymać już po kilku godzinach. Wadą, jest konieczność znajomości sekwencji nukleotydowej otaczającej amplifikowany fragment. Techniki analizy DNA oparte na metodzie PCR umożliwiają wykrywanie mutacji w sekwencji DNA, dzięki czemu znalazły one szerokie zastosowanie w badaniach chorób dziedzicznych. Do najprostszych wariantów metody PCR należy technika PCR multipleks. Polega ona na amplifikacji kilku eksonów badanego genu (od 3 do 7) różniących się wielkością, w jednej reakcji PCR. Technika ta wymaga użycia kilku par starterów w jednej mieszaninie reakcyjnej oraz użycia większej ilości polimerazy oraz trifosforanów deoksynukleotydów. Reakcja PCR multipleks jest bardzo często wykorzystywana w diagnostyce molekularnej do wykrywania delecji eksonów w genach, powodujących występowanie jednogenowych chorób dziedzicznych, jak np. w genie DMD u chorych z dystrofią mięśniową typu Duchenne a [10]. PCR-ASA (ang. allele specific amplification, allelowo-specyficzna amplifikacja) i PCR-ASO (ang. allele specific oligonucleotide, allelowo-specyficzna hybrydyzacja) są metodami pozwalającymi rozróżnić w badanym genie allel prawidłowy od allelu zmutowanego. W przypadku PCR-ASA do reakcji PCR stosuje się pary starterów komplementarnych do obu wersji genu. Obecność lub brak produktu reakcji PCR w badanej próbie świadczy o obecności mutacji lub jej braku w analizowanym genie. Z kolei, w badaniach typu PCR-ASO produkt

4 Techniki wykorzystywane w diagnostyce molekularnej chorób jednogenowych 489 reakcji PCR poddaje się hybrydyzacji z dwoma syntetycznymi sondami molekularnymi. Jedna z nich jest specyficzna dla prawidłowego genu, a druga dla genu zawierającego znaną mutację. Analiza sygnałów otrzymanych po hybrydyzacji z wyznakowaną sondą dostarcza informacji czy badany materiał zawiera mutację odpowiedzialną za wystąpienie choroby. Technika PCR- ASO jest z powodzeniem stosowana w diagnostyce molekularnej genu CFTR u chorych cierpiących na mukowiscydozę. Metody PCR-ASA oraz PCR-ASO są przykładami analizy bezpośredniej i wymagają znajomości badanej mutacji [6]. Technika PCR-RFLP polega na trawieniu produktów PCR enzymami restrykcyjnymi. W miejscu działania enzymu restrykcyjnego występuje polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP restriction fragment lenght polymorphism). Jest to jedna z podstawowych technik wykorzystywanych w genetyce molekularnej. Polimorfizmy RFLP objawiają się zanikiem lub utworzeniem miejsca, które jest rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Po amplifikacji badany gen poddaje się trawieniu, a następnie rozdziela w żelu agarozowym. W przypadku, gdy miejsce restrykcyjne jest obecne w analizowanym genie dochodzi do przecięcia cząsteczki DNA, co podczas analizy elektroforetycznej uwidacznia się w postaci dwóch fragmentów DNA. W przypadku braku miejsca rozpoznawanego przez restryktazę (miejsce restrykcyjne zniszczone przez mutację) na żelu widoczny jest tylko jeden fragment DNA. PCR- RFLP jest jedną z najprostszych metod wykrywania mutacji punktowych chorobach jednogenowych. Jest ona stosowana w diagnostyce molekularnej m.in. mukowiscydozy, fenyloketonurii, anemii sierpowatej czy hemofilii [6]. Metoda PCR-SSCP (ang. single strand conformation polymorphism, polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA) jest oparta na obserwacji, że nawet mutacja punktowa zmienia konformację (strukturę przestrzenną) pojedynczej nici DNA. Analizowanym materiałem są produkty PCR (namnożony ekson odpowiedniego genu), które potem są denaturowane i rozdzielane przy pomocy elektroforezy. Po denaturacji powstają jednoniciowe fragmenty DNA, których sposób migracji podczas elektroforezy zależny jest od konformacji. Fragmenty o zmienionej konformacji poruszają się w żelu w sposób odmienny w stosunku do fragmentów, w których nie występuje mutacja [3]. Technika PCR-SSCP cieszy się dużą popularnością i jest często stosowana jako metoda przesiewowa, która pozwala na wykrywanie nieznanych mutacji w znanych genach. Metoda analizy heterodupleksów (HA ang. heteroduplex analysis) jest kolejną techniką opartą na reakcji PCR, która może być wykorzystywana do poszukiwania nieznanych mutacji punktowych. Analiza opiera się na występowaniu dwóch alleli danego genu w układzie heterozygotycznym, allelu zmutowanego oraz prawidłowego. Pierwszym etapem analizy HA jest amplifikacja docelowej sekwencji. Otrzymane produkty poddaje się denaturacji za pomocą wysokiej temperatury, a następnie schładza. Podczas schładzania dochodzi do renaturacji, czyli ponownego łączenia się ze sobą nici komplementarnych, jak również nici nie w pełni komplementarnych (z mutacją). Hybrydyzacja nici komplementarnych prowadzi do powstania homodupleksów, natomiast nici nie w pełni komplementarnych do powstania heterodupleksów. Wynik analizy opiera się na analizie ruchliwości heterodupleksów w stosunku do homodupleksów po przeprowadzonym rozdziale elektroforetycznym [10]. Zazwyczaj ostatecznym narzędziem analizy DNA jest jego sekwencjonowanie, czyli ustalenie kolejności nukleotydów w cząsteczce DNA. Opracowano dwie metody określania sekwencji cząsteczek DNA: metodę kontrolowanej terminacji syntezy łańcuchów DNA (metoda dideoksy Sangera) oraz chemicznego zrywania wiązań (metoda Maxama i Gilberta). Obecnie metoda Sangera wyparła bardziej pracochłonną metodę chemiczną. Podstawą metody dideoksy jest enzymatyczne kopiowanie cząsteczki DNA, której sekwencja ma być określana za pomocą polimerazy DNA. Zmodyfikowane oraz odpowiednio wyznakowane trifosforany deoksyrybonukleotydów dodawane do reakcji powodują losowe przerywanie syntezy DNA przy każdej z czterech podstawowych zasad. W efekcie otrzymuje się serię cząsteczek DNA różniących się długością o jeden nukleotyd. Otrzymane cząsteczki rozdziela się za pomocą elektroforezy, a następnie odczytuje sekwencję matrycy znajdując końcową zasadę każdej syntetyzowanej cząsteczki DNA [9]. Obecnie coraz częściej stosuje się fluorescencyjne znakowanie dideoksynukloetydów i automatyczny odczyt sekwencji przy pomocy sprzężonego z komputerem czytnika laserowego [7]. Otrzymaną sekwencję nukleotydową należy porównać z sekwencją prawidłową, a następnie opisać charakter ewentualnej mutacji. Jednym z najnowszych osiągnięć współczesnej biologii molekularnej jest opracowanie tzw. mikromacierzy DNA (ang. DNA microarray). Mikromacierze DNA to uporządkowane zbiory fragmentów genów (sond molekularnych) w postaci jednoniciowego DNA lub oligonukleotydów unieruchomionych na nylonowych membranach albo szklanych lub plastikowych płytkach w ściśle określonym szyku. Technika ta polega na przygotowaniu sond molekularnych i stabilnym ich związaniu do powierzchni płytki szklanej lub plastikowej, przygotowaniu i wyznakowaniu próbek DNA przeznaczonych do analizy, a następnie hybrydyzacji próbek z sondami, odczytaniu sygnału hybrydyzacji i analizie danych za pomocą systemów informatycznych. Technikę mikromacierzy DNA wykorzystuje się m.in. do identyfikacji sekwencji oraz badania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów. Podsumowanie Diagnostyka molekularna służy do określania podłoża chorób uwarunkowanych genetycznie. W przypadku chorób jednogenowych strategia wyboru metody i postępowania zależy od stanu wiedzy na temat genu, w którym defekt powoduje chorobę oraz od stanu wiedzy o mutacjach występujących w tym genie. Najczęściej wśród całego spektrum technik molekularnych stosuje się opisane metody diagnostyki bezpośredniej.

5 490 Alina Liczbańska i inni Algorytm bezpośredniej diagnostyki molekularnej chorób jednogenowych obejmuje izolację materiału genetycznego (DNA lub RNA) oraz analizę mutacji z zastosowaniem technik hybrydyzacyjnych lub amplifikacji poszczególnych eksonów analizowanego genu i oceny produktu PCR przy pomocy technik elektroforetycznych. Należy jednak dodać, że techniki oparte na metodzie PCR cechują się większą czułością i specyficznością oraz obniżają czas i koszt analizy. W omówieniu tym nie można pominąć faktu wykorzystania technik diagnostyki molekularnej w mikrobiologii do identyfikacji patogenów oraz w diagnostyce chorób nowotworowych. Wykorzystując prostą reakcję amplifikacji z zastosowaniem odpowiednich starterów można wykryć obecność bakterii lub wirusa, korzystając z niewielkich ilości materiału biologicznego (np. z wymazu). Intensywne są również badania z zakresu diagnostyki molekularnej nowotworów. Prowadzone są np. badania genów BRCA1/ BRCA2 w raku piersi i jajnika [2]. Dynamicznie rozwija się technologia mikromacierzy (biochipów, genechipów), która służy do analizy próbki materiału genetycznego pacjenta z wykorzystaniem tysięcy unieruchomionych na chipie sekwencji. Badanie takie pozwala na szybkie uzyskanie informacji na temat poziomu ekspresji genu z tkanki pacjenta oraz na temat polimorfizmu i prawidłowości kopii genu. Diagnostyka molekularna wciąż się rozwija, a jej rozwiązania wybiegają daleko w diagnostyczną przyszłość. Piśmiennictwo 1. Latos-Bieleńska A.: Choroby genetyczne uwarunkowane obiegowe poglądy a rzeczywistość. Pediatr. Prakt. 1998, 6, 314, Bal J. (Red.): Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa Krawczyński M., Czarny-Ratajczak M.: Znaczenie badań molekularnych w dysmorfologii. W: Polski rejestr wrodzonych wad rozwojowych (Red.: Latos-Bieleńska A.). Ośrodek Wydawnictw Naukowych PAN, Friedman J.M. et al.: Genetics. Williams & Wilkins, Baltimore, Słomski R., Kwiatkowska J.: Diagnostyka molekularna chorób genetycznych. Post. Biol. Komórki, 1995, 22, 6, Słomski R. i wsp.: Diagnostyka molekularna. Post. Biol. Komórki, 1998, 25 supl. 10, 9 28 i Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w badaniach naukowych i diagnostyce molekularnej. Post. Biol. Komórki, 1998, 25 supl. 10, Krawczyński M., Czarny-Ratajczak M.: Współczesne badania genomu ludzkiego. Pediatr. Prakt., 1998, 6, 3 4, Siemieniako B. i wsp.: Zastosowanie badań hydryzacyjnych w diagnostyce molekularnej. Post. Biol. Kom., 2000, 27, supl. 14, Winter P.C., Hickey G.I., Fletcher H.L: Genetyka. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa Słomski R. (Red.): Przykłady analiz DNA. Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań 2004.