Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji

Transkrypt

1 Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ================================================================= Ćwiczenie 3 Amplifikacja genu metodą PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi Prowadzący: mgr Paulina Jędrak, mgr Anna Krajewska, mgr Małgorzata Bohdanowicz, mgr Olga Rodzik I. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR - ang. polymerase chain reaction) Jest to technika dzięki której możliwe jest otrzymanie dużej liczby kopii określonego fragmentu DNA. Technika została opracowana w 1983 przez Kary ego Mullisa za co w 1993 otrzymał on Nagrodę Nobla. Metoda ta opiera się na powieleniu (amplifikacji) zdefiniowanego odcinka DNA, oflankowanego przez regiony o znanej sekwencji, przez polimerazę DNA in vitro. Reakcja przeprowadzana jest w termocyklerze. Urządzenie to pozwala na sterowanie temperaturą (w zależności od etapu cyklu próbki są podgrzewane lub chłodzone) Do reakcji PCR potrzebne są: Dwuniciowa cząsteczka DNA, której fragment jest powielaną matrycą Para starterów (primery), czyli chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy o długości ok par zasad, o sekwencji komplementarnej do matrycowego DNA Termostabilna polimeraza DNA Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji 1. matryca - dwuniciowa cząsteczka DNA, której fragment chcemy powielić; Matrycą do syntezy DNA może być DNA liniowy, plazmidowy (ccc), całego genomu np. bakterii. Matryca DNA używana w reakcji PCR musi być czysta (OD 260/280 1,8-2,0). Ilość matrycy zależy od wielkości DNA i może się wahać w granicach rzędu pg (dla plazmidowego oraz fagowego DNA) do µg (dla genomowego DNA). DNA używane w reakcji PCR powinno być wolne od substancji mogących wywołać inhibicję reakcji PCR, np. EDTA/EGTA. 2. startery - zazwyczaj chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy o długości ok par zasad o sekwencji komplementarnej do matrycowego DNA. Należy zaprojektować je tak, aby: - zawierały ok. 50% par GC, - nie tworzyły struktur typu spinki do włosow (ang. hairpin), - nie zawierały fragmentow komplementarnych do drugiego startera, - temperatura obu primerów topnienia wynosiła ok o C; 3. termostabilna polimeraza DNA. Jedną z najczęściej obecnie stosowanych polimeraz jest termostabilna polimeraza DNA wyizolowana z termofilnej bakterii Thermus aquaticus (Taq polimeraza) - nie traci aktywności w temperaturze wymaganej do denaturacji DNA - produkt PCR posiada na końcu 3 da**. Innym przykładem częściej stosowanej polimerazy może być termostabilna polimeraza Pfu, odznaczająca się większą wiernością kopiowania - produkt PCR posiada tępe końce. 4. dntp (trójfosforany deoksynukleotydów) - stężenie każdego z dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) powinno wynosić 200 µm. Zbyt wysoka ilość dntp może wpływać inhibicyjnie na reakcję PCR.

2 5. Bufor reakcyjny zawierający odpowiednie ph i stężenie jonów niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania enzymów biorących udział w reakcji. Szczególną uwagę należy zwrócić na zawartość MgCl 2 i MgSO 4, których stężenie silnie wpływa na wydajność i specyficzność reakcji PCR. Optymalne stężenie dla różnego rodzaju PCR może być różne. Zbyt niskie stężenie jonów Mg 2+ może skutkować niską wydajnością. Jednak nadmiar wolnych jonów Mg 2+ może spowodować powstawanie niespecyficznych produktów. Powstające kompleksy jonów Mg 2+ z wolnymi dntp mogą hamować aktywność polimerazy. Każdy cykl składa się z następujących etapów: 1) denaturacji matrycowego DNA w temperaturze o C, w obecności dntp oraz nadmiaru primerów 2) hybrydyzacji (przyłączania) primerów do sekwencji homologicznych w matrycowym DNA, co następuje po ochłodzeniu mieszaniny do temperatury o C (ang. annealing) 3) wydłużania primerów przez polimerazę DNA w temperaturze 72 o C, co w rezultacie pozwala na syntezę fragmentu DNA. denaturacja hybrydyzacja Każdy cykl, składający się z denaturacji, przyłączania i syntezy, powtarzany jest wielokrotnie (od 25 do 40 razy). DNA będący produktem każdego cyklu, służy jako matryca w następnych cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększenie puli syntetyzowanego DNA. wydłużanie Zastosowanie PCR: - diagnostyka molekularna, - wykrywanie DNA w próbkach klinicznych, identyfikacja próbek w medycynie sądowej, analiza mutacji w chorobach nowotworowych, - synteza specyficznych sond, - tworzenie bibliotek genomów

3 Schemat przyrostu ilości amplifikowanego fragmentu DNA w kolejnych cyklach reakcji PCR; gwiazdką zaznaczono właściwy produkt reakcji. Przykładowe odmiany techniki PCR Technika PCR RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment LengthPolymorphism) pozwala na przykład odkryć niektóre mutacje w interesującej nas sekwencji DNA. Po namnożeniu odpowiedniego fragmentu (np. genu, którego mutacja wywołuje jakąś chorobę), trawi się go za pomocą tak zwanych enzymów restrykcyjnych. Są to białka, które rozpoznają, a następnie przecinają określoną krótką sekwencję. Jeśli w obrębie takiej sekwencji nastąpi zmiana (mutacja) - miejsce cięcia zniknie i uwidoczni się to we wzorze prążków, powstałych po rozdziale produktów reakcji PCR RFLP w żelu. Może się również zdarzyć, że w skutek mutacji powstaną nowe miejsca restrykcyjne, co również uwidoczni się za pomocą tej metody. Powielenie RNA umożliwia technika RT PCR (ang. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Polega ona na przepisaniu badanego RNA na DNA za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy. Tak otrzymany odcinek określa się jako cdna. Może on dalej być powielony jak podczas zwykłej reakcji PCR. Technika RT PCR jest szczególnie przydatna w diagnostyce chorób wirusowych gdyż wiele wirusów ma genomy zbudowane z RNA. Skrót RT PCR jest niekiedy używany także w odniesieniu do innej techniki Real Time PCR ( PCR w czasie rzeczywistym) jednak poprawny skrót nazwy tej techniki to qpcr, z ang. quantitative PCR - ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy DNA. Jest to metoda pozwalająca uzyskać dane o ilości badanego DNA (lub RNA, jeśli połączy się ją z techniką opisaną powyżej nazywana QRT-PCR). Jest to możliwe dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych, które reagują zmianami w emisji światła w zależności od ilości produktu w mieszaninie reakcyjnej. II. Analiza restrykcyjna wektora oraz produktu reakcji PCR Enzymy restrykcyjne zostały wyizolowane z wielu gatunków bakterii, w których pełnią funkcję obrony przed obcym DNA (np. wirusami). Są to enzymy należące do grupy endonukleaz, czyli enzymów przecinających nici DNA w środku cząsteczki. Dzięki ich obecności obcy DNA po znalezieniu się w komórce bakterii zostaje pocięty, natomiast DNA bakteryjny unika degradacji dzięki metylacji przez specyficzną metylazę. Nazewnictwo enzymy restrykcyjne określa się za pomocą symboli, np. EcoRI oznacza enzym wyizolowany ze szczepu R Escherichia coli, Hind III enzym wyizolowany ze szczepu Hemophilus influenzae serotyp d.

4 Liczba rzymska wynika z chronologii izolowania enzymów z tych samych mikroorganizmów. Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu. Izoschizomery enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia. Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia. Rozróżniamy trzy klasy enzymów restrykcyjnych, różniące się mechanizmem cięcia, rodzajem substratu, produktu i kofaktorami: Klasa I białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i Mg2+ działają zarówno jako restryktazy oraz kodyfikacyjne metylazy substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA Klasa II białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane przez Mg2+ substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencję specyficznie rozpoznawaną przez dany enzym cięcie obu nici zachodzi w obrębie rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS) większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-, sześcio-, lub ośmionukleotydowe. enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej Klasa III aktywowane przez jony Mg2+ i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionina. Endonukleazy restrykcyjne klasy III rozpoznają niesymetryczną sekwencję DNA, np.: AGACC EcoPI; CAGCAG EcoP15I; CGAAT HinfIII; CAGAG StyLTI i przecinają cząsteczkę DNA w odległości pz na prawo od rozpoznawanej sekwencji. Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. Wydaje się, że przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie, lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych. Stosując odpowiednio niskie stężenie enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki z tylko jedną przeciętą nicią. W inżynierii genetycznej wykorzystywane są głownie enzymy restrykcyjne klasy II czyli takie, które tną dwuniciowy DNA w obrębie lub w określonym miejscu w pobliżu rozpoznawanej sekwencji nukleotydowej. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe i obejmują zwykle 4 lub 6 nukleotydów, ale znane są enzymy, które rozpoznają sekwencje 5, 7 lub 8 nukleotydów. Dany rodzaj enzymu przecina DNA zawsze w taki sam sposób. Używając enzymu czwórkowego (rozpoznającego sekwencję czterech nukleotydów) otrzymuje się niewielkie fragmenty DNA (statystycznie dana sekwencja czterech nukleotydów występuje w DNA raz na 256 zasad). Enzym szóstkowy tnie DNA na znacznie większe fragmenty (dana sekwencja sześciu nukleotydów występuje raz na 4096 zasad). Produkty trawienia enzymami restrykcyjnymi analizuje się zazwyczaj stosując rozdział elektroforetyczny w żelach agarozowych, wykorzystując ujemny ładunek cząsteczek DNA. DNA uwidacznia się poprzez barwienie bromkiem etydyny, który świeci w świetle UV, a wielkość fragmentów określa poprzez porównanie z DNA wzorcowym. W sekwencji nukleotydowej danej cząsteczki DNA znajdują się miejsca rozpoznawane przez określony zbiór enzymów restrykcyjnych. Wzajemne ułożenie tych miejsc to mapa restrykcyjna, a wielkość fragmentów uzyskiwanych po trawieniu wybranymi spośród tych enzymów stanowi wzór restrykcyjny. Każda cząsteczka DNA ma określoną mapę i wzór restrykcyjny. Miejsce cięcia przez enzym restrykcyjny obu nici DNA może znajdować się naprzeciwko lub z przesunięciem o kilka nukleotydów. W pierwszym przypadku powstają tak

5 zwane tępe, a w drugim lepkie końce, które mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale mogą być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5 lub 3, w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego. Np. SmaI EcoRI 5` CCC GGG 3` tępe końce 5` CCC GGG 3` 3` GGG CCC 5` 3` GGG CCC 5` 5` G AATTC 3` lepkie końce 5` G AATTC 3` 3` CTTAA G 5` 3` CTTAA G 5` Możliwa jest także modyfikacja końców w celu uzyskania optymalnego fragmentu do klonowania, np. tępych, poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko, specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne, zakończonych na tępo), przed dołączeniem tych ostatnich należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą uzyskując lepkie końce lepkich, które mają cofniętą nić 3` - można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E. coli i kompletu nukleotydów. lepkich, które mają cofniętą nić 5`- można je wytępić, obcinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA przy użyciu nukleazy S1 lub polimerazy I E. coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3` 5`. Enzymy restrykcyjne są podstawowym narzędziem służącym do klonowania genów. Ich właściwości umożliwiają tworzenie fizycznych map DNA, izolację i identyfikację genów oraz diagnostykę molekularną. Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która kompletnie trawi 1 µg DNA wzorcowego (np. fag λ) w czasie 1 godziny w temperaturze optymalnej. Aktywność niespecyficzna (Star activity) pojawia się w przypadku, gdy warunki reakcji znacznie różnią się od optymalnych. Efektem jest zmiana (utrata) specyficzności enzymu Wysoka koncentracja glicerolu w mieszaninie reakcyjnej (>5% obj) Wysokie stężenie enzymu (pow. 100u) Niezoptymalizowany bufor (zasadowe ph; za wysokazawartość jonów) Przedłużony czas reakcji enzymatycznej Obecność związków organicznych takich jak: DMSO, etanol, glikol etylenowy Zastąpienie (lub zwiększona koncentracja) jonów magnezu innymi dwudodatnimi jonami Mn2+, Cu2+, Co2+ lub Zn2+ III. Część praktyczna - klonowanie fragmentu plazmidu pcb104 do wektora puc19 niosącego gen oporności na Ampicylinę (amp R ) oraz gen kodujący N-terminalną domenę β-galaktozydazy (lacz). UWAGA! Aby część praktyczna się powiodła i by nie dopuścić do zanieczyszczenia próbki całość pracy laboratoryjnej należy przeprowadzać pamiętając: - wszystkie czynności wykonywać w rękawiczkach (jeżeli rękawiczki w między czasie zostaną zabrudzone, należy je natychmiastowo zmienić na nowe) - używać buforów przeznaczonych wyłącznie do reakcji PCR - używać wyłącznie jałowych odczynników, tipsów i probówek Eppendorfa, pakowanych do jałowienia w rękawiczkach - nie chlapać roztworami DNA!!! - bardzo dokładnie pipetować

6 1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (do reakcji PCR) Matryca fragment plazmidu pcb104 unieaktywniający gen lacz, a z tym β-galaktozydazę Reakcja odbywa się w całkowitej objętości 25 μl. Przepis praktyczny na 1 reakcję (1 probówkę): UWAGA! Kolejność dodawania poszczególnych składników jest istotna! Probówka podczas dodawania poszczególnych składników powinna znajdować się w lodzie. Stock Objętość na 1 próbkę Stężenie końcowe Bufor (10x) 2,5 μl (1x) mieszanina dntp (10mM) 0,5 μl (200µM) primer Forvard (10µM) 0,25 μl (0,1µM) primer Revers (10µM) 0,25 μl (0,1µM) matrycowe DNA 1 μl polimeraza DNA (5U/µl) 0,1 μl woda destylowana dopełnić do 25 μl 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) Program reakcji PCR: 1 denaturacja wstępna 95 o C, 5 min Cykl PCR: 2 denaturacja 95 o C, 30 sekund 3 przyłączenie primera x o C, 30 sekund 4 wydłużanie 72 o C, 30 sekund 6 końcowe wydłużanie 72 o C, 5 min 30 cykli BamHI 3. Trawienie restrykcyjne wektora PUC19 enzymem BamHI oraz PstI 5 --G GATCC CCTAG G 5 PstI 5'--CTGCA G--3' 3'--G ACGTC 5' Mieszanina reakcyjna o całkowitej objętości 20 μl (dla trawienia pojedynczym enzymem): 1 μl enzym (FastDigest) 2 μl bufor (10X FastDigest Green Buffer) 2 μl DNA plazmidowego 15 ul wody Delikatnie wymieszać, krótko zwirować. Trawienie w 37 o C przez 5 minut inaktywacja 5 min 80 o C

7 4. Analiza produktu amplifikacji 1. Przygotować agarozę 1% w buforze 0.5x TAE 2. Wylać żel w odpowiednim aparacie, poczekać do zastygnięcia agarozy 3. Do komór aparatu nalać bufor 0.5x TAE, tak aby pokrywał on powierzchnię żelu 4. Do studzienek żelu nanieść próbki DNA po 10 μl z każdej reakcji PCR zmieszane z buforem obciążającym w proporcji 5:1 5. Rozdział prowadzić przy stałym napięciu 5V/cm długości żelu 6. Żel barwić w roztworze bromku etydyny i oglądać w świetle ultrafioletowym. Zagadnienia do samodzielnego opracowania: 1. Budowa kwasów nukleinowych. 2. Typy PCR. 3. Zastosowanie technik PCR. 4. Enzymy restrykcyjne (klasy, nazewnictwo, zastosowanie). Literatura: 1. Sęktas M. Zastosowanie inżynierii genetycznej w biotechnologii. Molekularne podstawy ekspresji genów 2. P.C.Turner, A.G. McLennan i inni Biologia molekularna krótkie wykłady 3. Ryszard Słomski (red.) Przykłady analiz DNA 4. Human Molecular Genetics