PCR. Aleksandra Sałagacka

Transkrypt

1 PCR Aleksandra Sałagacka

2 Reakcja PCR naśladuje proces replikacji DNA in vitro pozwala na amplifikację określonego krótkiego (kilkadziesiąt kilka tys.pz) fragmentu DNA obecnie najważniejsze narzędzie biologii molekularnej

3 Polymerase Chain Reaction Polimerazowa reakcja łańcuchowa Łańcuchowa reakcja polimerazy produkt powstały w jednym cyklu reakcji zostaje użyty jako matryca w następnych cyklach reakcja łańcuchowa reakcja katalizowana przez polimerazę DNA

4 Cechy reakcji PCR szybkość kilka godz. wydajność kopii selektywność powielana jest tylko wybrana sekwencja czułość możliwe powielenie pojedynczej cząsteczki DNA prostota wykonania ryzyko kontaminacji!!!

5 Kary Mullis opracował metodę PCR 1993 r. Nagroda Nobla z chemii

6 Składniki reakcji PCR polimeraza DNA katalizuje reakcję bufor zapewnia odpowiednie środowisko reakcji (ph, siła jonowa) Mg 2+ kofaktor polimerazy DNA dntp substraty do budowy nowych nici DNA DNA matryca do budowy nowych nici startery wyznaczają miejsce amplifikacji

7 Polimeraza DNA termostabilna polimeraza Taq Thermus aquaticus od syntezy nowej nici DNA wymaga istniejącej już nici matrycowe DNA może wydłużać jedynie istniejący już fragment DNA starter (primer)

8

9 Startery (primers) oligonukleotydy o dł pz syntetyzowane chemicznie komplementarne do sekwencji otaczających (flankujacych) powielany region konieczna znajomość tych sekwencji do zaprojektowania starterów! zapewniają selektywność reakcji PCR dostarczają wolny koniec 3 do syntezy nowych nici przez polimerazę DNA

10 dntps trifosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleozydów: datp, dctp, dgtp, dttp substraty do syntezy nowych nici DNA NH 2 N N O O - P O - O O P O - O O P O - O N O N HO

11 Etapy reakcji PCR denaturacja matrycowego DNA 25-40x wydłużanie (elongacja) starterów budowa nowych nici DNA przyłączanie (annealing) starterów do nici matrycowych

12 Denaturacja 92-96ºC Pod wpływem wysokiej temperatury (92-96ºC) dochodzi do rozerwania wiązań wodorowych między komplementarnymi zasadami dsdna

13 Annealing 45-65ºC Startery hybrydyzują z sekwencjami komplementarnymi na końcach 3 powielanego fragmentu DNA.

14 Elongacja 72ºC Polimeraza dobudowuje kolejne nukleotydy do starterów następuje synteza nici komlementarnych do nici matrycowej. Kierunek syntezy: 5 3

15 jeden cykl 55 kolejne etapy reakcji PCR wyznaczane są przez zmianę temperatury termocykler

16 Teoretycznie, w n cyklach z jednej cząsteczki powstaje jej 2 n kopii.

17 Wizualizacja produktu reakcji PCR elekroforeza w żelu agarozowym, poliakrylamidowym z użyciem barwników: bromek etydyny, sole srebra

18 Optymalizacja PCR potencjalnie wiele zmiennych każda para starterów musi być optymalizowana Zwykle optymalizacji wymagają: stężenia Mg 2+ parametry starterów krytyczne matrycy temperatura annealingu czas wydłużania

19 Stężenie Mg 2+ jony magnezowe kofaktor polimerazy DNA wpływ na aktywność enzymatyczną stężenie zbyt niskie słaby produkt lub brak produktu steżenie zbyt wysokie niespecyficzne produkty

20 Tepreatura annealingu odpowiednia zbyt wysoka zbyt niska brak przyłaczania brak produktu przyłaczanie niespecyficzne niespecyficzne produkty

21 Modyfikacje PCR

22 Modyfikacje PCR AFLP Alu-PCR AS-PCR Asymmetric PCR Colony PCR DD-PCR Degenerate PCR Hot-start PCR Inverse PCR In situ PCR Long-PCR Methylation Specific PCR Multiplex PCR Nested PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP QC-PCR RACE-PCR RAPD Real-Time PCR Rep-PCR RT-PCR Touchdown PCR

23 Gniazdowy PCR (nested PCR) dwie różne pary starterów zewnętrzne i wewnętrzne dwie reakcje PCR: pierwsza ze starterami zewnętrznymi, druga ze starterami wewnętrznymi produkt pierwszej reakcji stanowi matrycę w reakcji drugiej sekwencja powielana przy użyciu starterów wewnętrznych leży w obrębie sekwencji powielanej przy użyciu starterów zewnętrznych zwiększona czułość i swoistość reakcji

24

25 jedna reakcja PCR Multiplex PCR więcej niż jedna para starterów jednoczesne powielanie więcej niż jednej sekwencji, np.: dwóch różnych genów, kilku różnych fragmentów tego samego genu szybkie analizowanie dużych obszarów DNA oszczędność czasu i pracy reakcje z tzw. wzorcem wewnętrznym poza wybranym fragmentem DNA powielany jest matryca standardowa możliwość kontrolowania poprawności przebiegu reakcji i porównawczych analiz ilościowych

26

27 Reverse Transcription - PCR PCR poprzedzona reakcją odwrotnej transkrypcji (RT) odwrotna transkrypcja przepisanie sekwencji mrna na tzw. komplementarne DNA (cdna) starter oligo-dt starter specyficzny dla wybranego mrna 6-ciomery tzw. Random Hexamer Primers (RH) odwrotna transkryprtaza ocena ekspresji genów (jakościowa lub półilościowa)

28 R T P C R

29 Metody wykrywania mutacji niezdefiniowanych

30 PCR-SSCP Single strand conformation polymorphism polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych ssdna przyjmuje w warunkach niedenaturujących unikalną strukturę drugo- i trzeciorzędową konformacja ta jest zależna od sekwencji nukleotydowej różne konformery różnią się ruchliwością elektroforetyczna pojedyncze różnice w sekwencji, wywołane mutacją punktową powodują zróżnicowaną migrację i charakterystyczne położenie w żelu poliakrylamidowym.

31 PCR-SSCP etapy: 1) reakcja PCR powielenie badanego fragmentu DNA 1) denaturacja dsdna (silna zasada, formamid, wysoka temp.) - powstają ssdna 1) elektroforeza żelowa ssdna w warunkach niedenaturujących 1) wykrywanie konformerów pojedynczych nici w żelu (np. wybarwienie bromkiem etydyny)

32

33 PCR-HDA Heteroduplex analysis - analiza heterodupleksów ssdna, powstałe w procesie denaturacji dsdna, podczas powolnej renaturacji łaczą się przypadkowo w struktury dwuniciowe, tzw. dupleksy możliwe jest łączenie się nici w pełni do siebie komplementarnych (homodupleksy), jak i nie (hereodupleksy) homozygoty homodupleksy heterozygoty hetero- i homodupleksy heterodupleksy posiadają mniejszą ruchliwość elektroforetyczną (rozluźnienie struktury w miejscu niepełnego sparowania)

34 HDA etapy: 1) reakcja PCR powielenie badanego fragmentu DNA 1) denaturacja dsdna (wysoka temp.) powstają ssdna 1) renaturacja ssdna łączenie ssdna w homoi/lub heterodupleksy 1) elektroforeza dupleksów w żelu poliakrylamidowym 1) wykrywanie dupleksów w żelu (np. wybarwienie bromkiem etydyny)

35

36 PCR-CMC Chemical mismatch cleavage chemiczne rozszczepianie niesparowanych heterodupleksów podobnie jak HDA wykorzystuje zjawisko powstawania heterodupleksów niesparowane zasady w heterodupleksach poddaje się modyfikacji chemicznej (cytozyna hydroksylamina, tymina czterotlenek osmu) zmodyfikowane cząsteczki DNA ulegają przecięciu pod wpływem piperydyny zmiany w obrazie elektroforetycznym

37 PCR-DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - elektroforeza w żelu z gradientem czynnika denaturującego dsdna ulega denaturacji przy różnych stężeniach związków denaturujących w zależności od składu zasad i sekwencji nukleotydowej zw. denaturujace: formamid, mocznik, chlorowodorek guanidyny produkty PCR o rożnej sekwencji będą w rożnych miejscach żelu ulegać denaturacji zmiany w obrazie elektroforetycznym jeśli czynnikiem denaturującym jest temperatura PCR-TGGE

38 Metody wykrywania mutacji zdefiniowanych

39 PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych mutacja powoduje powstanie lub zanik miejsca rozpoznawanego przez określony enzym restrykcyjny zmiana w obrazie elektroforetycznym po trawieniu e. restrykcyjnym (zmiana liczby i długości fragmentów DNA)

40 PCR-RFLP etapy: 1) reakcja PCR powielenie badanego fragmentu DNA 1) trawienie produktu PCR enzymem restrykcyjnym 1) elektroforeza produktu reakcji trawienia 1) ocena wzoru prążkowego

41

42 Allele Specific PCR (AS-PCR) dwie równoległe reakcje PCR dla tej samej próby badanej jeden starter wspólny dla obu reakcji drugi starter swoisty dla sekwencji zmutowanej lub niezmutowanej komplementarny do sekwencji, w której możliwa jest zmiana mutacyjna ocena mutacji obecność/braku produktu w obydwu reakcjach PCR

43

44

45 PCR-ASO Allele specific oligonucleotide hybrydyzacja z allelowo-specyficznymi sondami oligonukleotydowymi sondy znakowane oligonukleotydy (fluorescencyjnie, izotopowo) dwie sondy - jedna komplementarna do allela dzikiego, druga do allela zmutowanego

46 PCR-ASO etapy: 1) reakcja PCR powielenie badanego fragmentu DNA 1) naniesienie produktu PCR na membrany nylonowe 1) naniesienie sond na membrany 1) hybrydyzacja sondy-produkt PCR 1) detekcja sygnałów do shybrydyzowanych sond ocena genotypu

47