Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)

Transkrypt

1 Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ============================================================================ Ćwiczenia 6 i 7 Analiza liczby kopii plazmidu z wykorzystaniem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy Prowadzący: dr Lidia Boss UWAGA: Po zakończeniu ćwiczeń nr 6 i nr 7 proszę o przygotowanie jednego sprawozdania. W trakcie ćwiczeń numer 6 i 7 odbędą się dwa kolokwia (po jednym na każdym ćwiczeniu). Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. quantitative polymerase chain reaction qpcr) jest techniką, która umożliwia określenie ilości matrycowego DNA w badanej próbce. Skład mieszaniny reakcyjnej w przypadku qpcr jest zbliżony do standardowej reakcji PCR (tabela 1). Główną różnicę pomiędzy tymi technikami stanowi zastosowanie znaczników fluorescencyjnych, które umożliwiają obserwację przyrostu produktu reakcji w czasie rzeczywistym. Rodzaj stosowanych w reakcji qpcr znaczników fluorescencyjnych może różnić się w zależności od celu eksperymentu. W ramach niniejszych zajęć omówimy szczegółowo technikę qpcr z zastosowaniem barwnika fluorescencyjnego SYBR Green II. Informacje na temat innych znaczników fluorescencyjnych można znaleźć w materiałach wymienionych w spisie literatury. Tabela 1. Porównanie składu mieszaniny reakcyjnej stosowanej do reakcji PCR i qpcr. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) Ilościowa łańcuchowa reakcja polimerazy (qpcr) Woda Woda bufor dostosowany do rodzaju polimerazy bufor dostosowany do rodzaju polimerazy jony magnezu jony magnezu mieszanina deoksynukleotydów (datp, dctp, dgtp, dttp) mieszanina deoksynukleotydów (datp, dctp, dgtp, dttp) termostabilna polimeraza termostabilna polimeraza Startery Startery matrycowy DNA matrycowy DNA znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II) 1. Technika qpcr z zastosowaniem barwnika SYBR Green II. Cykl reakcji w technice qpcr składa się z trzech etapów: 1) Denaturacja DNA; etap ten polega na zerwaniu pod wpływem temperatury (95 C) wiązań wodorowych matrycowej helisy DNA i rozdzieleniu jej na dwie nici. 2) Hybrydyzacja starterów i poszczególnych nici DNA; w temperaturze 50 C komplementarne do sekwencji DNA startery przyłączają się do matrycowej nici DNA. 3) Wydłużanie starterów (elongacja); w temperaturze 60 C polimeraza DNA wydłuża startery przyłączone do matrycowej nici DNA. Powyższe etapy składają się na jeden cykl reakcji qpcr, który powtarzany jest zwykle 45 razy. W wyniku każdego cyklu z jednej cząsteczki matrycowego DNA powstają dwie cząsteczki potomne (ryc. 1). Rycina 1. Schemat przedstawiający proces amplifikacji DNA w przebiegu reakcji PCR.

2 Obecny w mieszaninie reakcyjnej, barwnik SYBR Green II ma zdolność wiązania się z dwuniciowym DNA (ryc. 2). SYBR Green II w roztworze (niezwiązany z DNA) charakteryzuje się stosunkowo niskim poziomem fluorescencji, natomiast po związaniu z DNA, poziom fluorescencji wzrasta nawet 1000-krotnie. Termocykler wykorzystywany do amplifikacji DNA metodą qpcr wyposażony jest w detektor, który wykonuje pomiar fluorescencji na etapie wydłużania starterów w każdym cyklu. Ilość barwnika związanego z DNA rośnie wraz z przyrostem produktów reakcji (DNA), zatem poziom fluorescencji jest wprost proporcjonalny do ilości DNA w próbce w danym momencie. 1. Denaturacja 2. Hybrydyzacja 3. Elongacja Rycina 2. Detekcja DNA z wykorzystaniem barwnika SYBR Green II. Barwnik wiąże się z dwuniciowym DNA, powstającym w przebiegu reakcji qpcr. Związanie SYBR Green II z DNA powoduje wzrost poziomu fluorescencji proporcjonalny do ilości DNA w próbce w danym momencie. Ostatnim etapem reakcji qpcr z wykorzystaniem znacznika SYBR Green II jest określenie temperatury topnienia (ang. melting temperature Tm) produktów reakcji qpcr. Etap ten ma miejsce po zakończeniu amplifikacji DNA, czyli po przeprowadzeniu ostatniego, czterdziestego piątego, cyklu PCR. Wartość Tm DNA zależy od ilości poszczególnych deoksyrybonukleotydów tworzących DNA (im więcej par G:C, tym wyższa temperatura topnienia DNA) oraz od długości cząsteczki DNA (im dłuższa helisa DNA, tym wyższa temperatura topnienia). Określenie wartości Tm DNA powstałego w wyniku reakcji qpcr pozwala na oszacowanie, czy w mieszaninie obecne są cząsteczki DNA o tej samej długości i kompozycji nukleotydowej, czy też w wyniku reakcji powstały produkty niejednorodne cząsteczki DNA różniące się składem i długością. W tym celu mieszanina reakcyjna zostaje schłodzona do 4 C, a następnie jest stopniowo ogrzewana aż do temperatury 95 C (ryc.3). Wyniki pomiaru fluorescencji prowadzonego podczas stopniowego ogrzewania mieszaniny umożliwiają wykonanie tzw. krzywej topnienia (krzywej dysocjacji) oraz określenie temperatury, w której dochodzi do denaturacji (topnienia) DNA (ryc. 4). Dla jednorodnych pod względem długości i składu cząsteczek DNA wymienione parametry będą takie same. Temperatura Cykl 1 Cykl 2 Badanie Tm produktów reakcji Etapy amplifikacji DNA 95 C Etap 1: Denaturacja 60 C Etap 3: Wydłużanie 50 C Etap 2: Hybrydyzacja 4 C

3 Rycina 3. Schemat przedstawiający zmiany temperatury w przebiegu reakcji qpcr oraz odpowiadające im etapy reakcji. Reakcję qpcr, podobnie jak standardową technikę PCR, można podzielić na 3 etapy: 1. Denaturację DNA. 2. Hybrydyzację starterów i poszczególnych nici DNA 3. Wydłużanie starterów Powyższe etapy składają się na jeden cykl reakcji qpcr, który powtarzany jest zwykle 45 razy. W wyniku każdego cyklu z jednej cząsteczki matrycowego DNA powstają dwie cząsteczki potomne. Barwnik SYBR Green II wiąże się z dwuniciowym DNA, co powoduje wzrost poziomu fluorescencji próbki. Kolorem zielonym oznaczono momenty, w których wykonywany jest pomiar poziomu fluorescencji. Zielona linia oznacza pomiar poziomu fluorescencji podczas stopniowego ogrzewania mieszaniny reakcyjnej, w celu określenia temperatury topnienia (Tm) produktów reakcji. Rycina 4. Krzywa dysocjacji produktów reakcji qpcr. 2. Interpretacja wyników reakcji qpcr z wykorzystaniem SYBR Green II. Wynikiem reakcji qpcr z wykorzystaniem barwnika SYBR Green II jest wykres obrazujący zmiany poziomu fluorescencji w zależności od czasu (numeru cyklu) (ryc. 5). Podstawową informacją, którą można uzyskać na podstawie takiego wykresu jest numer cyklu progowego (ang. treshold cycle Ct). Cykl progowy, to ten cykl reakcji qpcr, w którym dochodzi do akumulacji DNA w ilości wystarczającej, aby poziom fluorescencji barwnika przekroczył poziom podstawowy ( poziom tła ). Moment ten zostanie uzyskany szybciej w próbkach, które zawierają więcej matrycowego DNA, niż w próbkach, które zawierają matrycowego DNA mniej, zatem numer cyklu progowego jest odwrotnie proporcjonalny do ilości DNA w próbce. Zależność ta umożliwia oszacowanie początkowej ilości matrycowego DNA w badanej próbce na podstawie tzw. krzywej wzorcowej. W celu przygotowania krzywej wzorcowej należy wykonać szereg reakcji qpcr z wykorzystaniem znanych ilości matrycowego DNA, następnie określić wartość Ct dla poszczególnych próbek o znanej ilości matrycowego DNA. Na podstawie uzyskanych wyników zostaje wykreślona krzywa wzorcowa, czyli wykres zależności numeru cyklu progowego od ilości DNA w próbce (ryc. 6). Nachylenie wykresu (ang. slope) umożliwia określenie wydajności reakcji i powinno mieścić się w zakresie między -3.2 a -3.6.

4 Poziom fluorescencji Podstawowy poziom fluorescencji (barwnik niezwiązany z DNA) Poziom fluorescencji przekraczający poziom podstawowy (ang. threshold) Minimalny poziom fluorescencji wykrywany przez detektor Numer cyklu Rycina 5. Wykres zmian poziomu fluorescencji w zależności od numeru cyklu reakcji. Rycina 6. Krzywa standardowa dla reakcji qpcr z wykorzystaniem barwnika SYBR Green II. Na osi Y zaznaczono numery cykli reakcji qpcr, natomiast na osi X umieszczono wartości określające ilość matrycowego DNA (np. liczbę kopii plazmidu lub masę DNA wyrażoną w nanogramach). Poszczególne punkty widoczne na wykresie oznaczają wynik reakcji dla próbek zawierających znaną ilość matrycowego DNA, czyli numer cyklu progowego dla prób zawierających np. 1, 10, 100 i 1000 kopii plazmidu. Można zauważyć, że numer cyklu progowego wzrasta wraz ze spadkiem ilości matrycowego DNA w próbce. Na podstawie nachylenie wykreślonej krzywej (ang. slope) oszacowano wydajność (ang. efficiency) przeprowadzonej reakcji qpcr. 3. Zastosowanie qpcr w diagnostyce. Technika qpcr jest coraz częściej stosowaną metodą diagnostyczną. Metodę tę stosuje się w diagnostyce medycznej m.in. w celu wykrycia i identyfikacji lekoopornych mutantów patogennych bakterii (np. wankomycynoopornych szczepów Enterococcus faecium VRE) w próbkach moczu, krwi itp., co ułatwia szybkie zastosowanie odpowiedniej antybiotykoterapii. Technika ta umożliwia także określenie tzw. polimorfizmu SNP, co jest pomocne przy diagnostyce chorób genetycznych. Ilościowa łańcuchowa reakcja polimerazy umożliwia również oszacowanie ilości patogenów w badanej próbce. Możliwość ta wykorzystywana jest np. w diagnostyce prowadzonej u nosicieli HIV. Określenie metodą qpcr ilości cząstek cytomegalowirusa we krwi tych osób pozwala na oszacowanie ryzyka zachorowania u pacjentów o obniżonej odporności oraz monitorowanie skuteczności zastosowanej terapii antywirusowej. Przykładem zastosowania techniki qpcr w diagnostyce środowiskowej może być detekcja i określanie ilości bakterii indykatorowych w próbkach wody morskiej, w celu określenia klasy czystości wody. Metoda ta znajduje również zastosowanie w badaniach próbek żywności i wody pitnej w celu wykrycia patogennych bakterii (np. E. coli O157:H7). W porównaniu ze standardową metodą PCR, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy jest metodą znacznie szybszą (wynik uzyskiwany jest po około 1 godzinie), stąd można się również spotkać z określeniem tej metody jako rapid PCR. Zarówno czułość detekcji badanego czynnika (np. patogennych bakterii), jak i specyficzność w stosunku do danego DNA w przypadku obu metod jest porównywalna. Ze względu na fakt, że w przypadku qpcr zarówno amplifikacja DNA, jak i jego detekcja prowadzone są w tej samej probówce, metoda ta jest obarczona niższym ryzykiem zanieczyszczenia próbek niż standardowa technika PCR.

5 4. Określenie relatywnej liczby kopii plazmidu z wykorzystaniem techniki qpcr Bakterie Escherichia coli niosące toksynę Shiga (Shiga toxin-producing Escherichia coli STEC) są przyczyną zakażeń, które mogą prowadzić do krwawej biegunki oraz poważnych powikłań, takich jak zespół hemolityczno-mocznicowy. Według raportu Centrum Zapobiegania i Kontroli Chorób CDC, szczepy STEC tylko w USA powodują około zachorowań rocznie, z czego około 90 kończy się śmiercią pacjenta. Geny kodujące toksynę Shiga w szczepach STEC znajdują się w DNA lizogenizującego faga, wbudowanym w chromosom bakteryjny. Indukcja profaga i rozpoczęcie cyklu litycznego jest bezpośrednio związana z syntezą i uwolnieniem toksyny Shiga. Poważnym problemem w terapii tego typu zakażeń jest fakt, że niektóre antybiotyki stosowane w terapii zakażeń bakteryjnych powodują indukcję profaga, a tym samym zaostrzenie objawów choroby. W związku z tym niezwykle istotnym etapem w leczeniu zakażeń szczepami STEC jest szybka diagnostyka, w celu zastosowania odpowiedniej strategii leczenia. Metoda qpcr jest jedną z metod diagnostycznych zalecanych przez CDC w przypadkach, w których podejrzewa się zakażenie szczepami STEC. Umożliwia ona szybkie (wynik otrzymujemy po około godzinie) określenie czy dany przypadek infekcji jest spowodowany przez szczep Escherichia coli, niosący geny toksyny Shiga. Celem niniejszych zajęć będzie określenie względnej liczby kopii plazmidów zawierających fragment genomu faga kodującego toksyny Shiga w odniesieniu do liczby komórek bakteryjnych obecnych w badanej próbce. Ze względów bezpieczeństwa, hodowle bakterii wykorzystane w czasie ćwiczeń zawierają mikroorganizmy pozbawione genów kodujących toksyny. Należy przeprowadzić następujące kroki: 1. Oszacowanie liczby komórek bakteryjnych w badanej próbce hodowli na podstawie odczytu absorbancji przy długości fali 600 nm: - Wykonujemy pomiar absorbancji hodowli bakteryjnej przy długości fali 600 nm - Na podstawie uzyskanego wyniku określamy ilość komórek bakteryjnych w 1ml hodowli zakładając, że 1ml hodowli o gęstości optycznej OD 600 =0,1 zawiera 10 8 komórek bakteryjnych 2. Przygotowanie matrycy do reakcji qpcr: - 1 ml hodowli bakteryjnej inkubujemy przez 5 minut w temperaturze 95 C - Przygotowujemy seryjne rozcieńczenia hodowli bakteryjnej poprzez dodanie 10 µl zawiesiny bakterii do 90 µl wody 3. Przygotowanie krzywej wzorcowej z wykorzystaniem próbek zawierających znaną ilość plazmidowego DNA (przygotowuje osoba prowadząca zajęcia). 4. Przygotowanie mieszaniny do reakcji qpcr: 5. Literatura: Mieszanina na 5 reakcji : - Woda - 7,5 µl - 2 x SYBR - 25 µl - Starter I - 2,5 µl - Starter II - 2,5 µl 37.5 µl, mieszaninę rozdzielić po 7,5 µl do odpowiednich studzienek na płytce 96-cio dołkowej Do każdej studzienki nałożyć 2,5 µl rozcieńczonej próbki ( ) 5. Analiza uzyskanych wyników oraz elektroforeza agarozowa produktów reakcji. 1. Introduction to quatitative PCR. Methods and Applications Guide. (Agilent Technologies) 2. Brzozowska E., Bazan J., Gamian A. (2010) Funkcje białek bakteriofagowych. Postepy Hig Med Dosw 65: Węgrzyn G., Węgrzyn A. (2006) Replikacja DNA bakteriofaga λ nowe odkrycia dokonane przy użyciu starego modelu badawczego. Postępy Biochemii 52: Zagadnienia do samodzielnego przygotowania: 1. Charakterystyka bakteriofagów (fagi łagodne i zjadliwe) na przykładzie bakteriofagów: λ, M13, P1, T4. 2. Cykle rozwojowe bakteriofagów (cykl lityczny, lizogenia, pseudolizogenia, infekcja przewlekła, etapy rozwoju bakteriofagów, inhibicja lizy). 3. Wyjaśnić pojęcia: profag, adsorpcja, latencja, eklipsa, liza od zewnątrz. 4. Replikacja DNA faga λ (etapy replikacji DNA, etapy inicjacji replikacji DNA, rola białek fagowych i białek gospodarza, białko inicjatorowe, helikaza, białka opiekuńcze, replikacja według modelu sigma, replikacja według modelu theta). Zadania: 1. Seryjne rozcieńczenie roztworu DNA plazmidowego: W probówce nr 1 znajduje się 100 µl roztworu plazmidowego DNA o stężeniu 200 ng/µl. 10 µl roztworu plazmidowego DNA z probówki nr 1, przeniesiono do probówki nr 2 zawierającej 90 µl wody. Jakie będzie stężenie DNA w probówce nr 2? Procedurę

6 powtórzono w ten sam sposób dodając 10 µl roztworu z probówki nr 2 do probówki nr 3, z probówki nr 3 do probówki nr 4 itd. (rycina 7.) Jakie będzie stężenie DNA w pozostałych probówkach? Rycina 6. Seryjne rozcieńczanie roztworu DNA plazmidowego. 2. Wykreślenie krzywej standardowej: W celu wykonania krzywej standardowej przeprowadzono reakcję qpcr z wykorzystaniem 1000, 100, 10 i 1 kopii plazmidowego DNA. Uzyskano następujące wyniki: Nr próbki Liczba kopii plazmidu użytego jako matryca do reakcji qpcr Wynik reakcji (numer cyklu progowego dla danej próbki) Na podstawie danych z tabeli wykreśl krzywą standardową:

7 Ct liczba kopii plazmidu 3. Określenie liczby kopii plazmidu w badanej próbce na podstawie krzywej standardowej. Przeprowadzono analizę liczby kopii plazmidu w próbce hodowli A z wykorzystaniem techniki qpcr. Hodowlę A rozcieńczono 1000 razy, a następnie do reakcji qpcr wykorzystano 2,5 µl rozcieńczonej hodowli. Poziom fluorescencji podczas reakcji qpcr przekroczył poziom progowy w 18 cyklu reakcji (Ct A =18). Na podstawie krzywej standardowej (ryc. 7) oszacuj liczbę kopii plazmidu w nie rozcieńczonej próbce A. Pamiętaj, że badana próbka była 1000 razy rozcieńczona. Ct liczba kopii plazmidu Rycina 7. Przykładowa krzywa standardowa. 4. Określenie relatywnej liczby kopii plazmidu w odniesieniu do liczby komórek bakteryjnych w badanej hodowli. Na podstawie wyniku poprzedniego zadania oszacuj przybliżona liczbę kopii plazmidu w przeliczeniu na 1 komórkę bakteryjną, wiedząc, że hodowla A miała gęstość optyczną OD 600 ~0,2. (Przyjmij, że w 1ml hodowli bakteryjnej o OD 600 ~0,1 znajduje się 10 8 komórek bakteryjnych )