O trawieniu restrykcyjnym

Transkrypt

1 O trawieniu restrykcyjnym Enzymy II klasy, Mg 2+, dsdna z rozpoznawaną sekwencją, tępe, lepkie (kohezyjne) końce, warunki reakcji bufor o różnym stężeniu NaCl i określonym ph BSA -stabilizator 37 o C /lub inna/ aktywność starowa przerwanie trawienia nie koniecznie o C EDTA ph 8,0 do stęż. 10mM ekstrakcja fenolem CO DAJE NAM TRAWIENIE RESTRYKCYJNE? Fragmenty DNA na żelu w postaci prążków o identycznej sekwencji, ( precyzyjna obróbka DNA, powtarzalność fragmentacji cząsteczki) mapy restrykcyjne = obraz cząsteczki z zaznaczonymi miejscami rozpoznawanymi przez różne RE, z uwzględnieniem odległości między nimi, podstawy do mapowania genetycznego (RFLP) identyfikacja mutacji, diagnostyka, rekombinowanie i klonowanie genów.

2 pz pz pz Długość miejsca restrykcyjnego determinuje długość fragmentów restrykcyjnych Większość miejsc restrykcyjnych to sekwencje palindromowe metylacja dam grupa metylowa jest przyłączona do adeniny w sekwencji GATC zapisujemy G m ATC. metylacja dcm grupa metylowa jest przyłączona do cytozyny w sekwenji CC(AT)GG zapisujemy C m C(A/T)GG.

3 Jednostka aktywności enzymatycznej enzymu restrykcyjnego 1 UNIT taka ilość enzymu, która - trawi całkowicie 1 g dzikiego faga - w optymalnych warunkach - w ciągu 1 godziny

4 DEFINICJE I ZASADY Elektroforeza = ruch jonów i makromolekuł obdarzonych ładunkiem elektrycznym poprzez medium w wyniku przyłożonego napięcia Makromolekuły rozdzielane są ze względu na 1 wielkość 2 strukturę 3 rozkład ładunku Dla liniowej cząsteczki szybkość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do log 10 z masy cząsteczkowej

5 Elektroforeza DNA na sitach molekularnych czyli żelach agarozowych ( pz)/poliakrylamidowych (5-500pz) pozwala: rozdzielić fragmenty DNA zidentyfikować fragmenty DNA oczyścić fragmenty DNA inna technika? DNA na żelu jest barwione za pomocą EtBr (>10ng dwuniciowego DNA, 1973) lub SYBR Gold (>20pg dwuniciowego DNA) i wizualizacja pod UV (albo światło niebieskie) Prążki mogą być wycięte z żelu i wykorzystane Agaroza polimer galaktozy (~800 cząsteczek) po zestaleniu tworzą się kanaliki nm Akrylamid neurotoksyna Rozdzielanie bardzo dużych fragmentów DNA - PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Schwarz i Cantor, 1984)

6 Czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w żelu (szybkość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do log 10 z liczby par zasad fragmentu DNA) Wielkość cząsteczki konformacja DNA koncentracja agarozy/akrylamidu wartość przyłożonego napięcia skład nukleotydowy i temperatura obecność barwników interkalacyjnych skład buforu do elektroforezy (siła jonowa)

7 Bufory do elektroforezy DNA TAE- Tris-acetate, EDTA 1x 40 mm Tris-acetate 1 mm EDTA ph 8,0 TBE- Tris-borate, EDTA 1x 89 mm Tris-borate 2 mm EDTA ph 8,0 0.5x 45 mm Tris-borate 1 mm EDTA ph 8,0 TPE- Tris phosphate, EDTA 1x 90 mm Tris-phosphate 2 mm EDTA ph 8,0

8 Typy agarozy Standardowe high melting np. SeaKam LE, T G = C Low melting/gelling - np. SeaPlaque, NuSieveGTG, T G = C np. do ekperymentów gdzie trzeba oczyścić długi fragment DNA z żelu O wysokiej rozdzielczości np. MetaPhor zastępują żele akrylamidowe Do blottingu Agarozy do specjalnych aplikacji są drogie

9 zwiększają gęstość próbki nadają próbce kolor migrują w stronę anody(+) z określoną szybkością: -bromophenol blue w 0.5xTBE jak dsdna 300pz -xylene cyanol - w 0.5xTBE jak dsdna 4kb

10 Łączenie DNA - Ligacja Ligaza DNA - tworzy wiązania fosfodiestrowe pomiędzy nukleotydami w łańcuchu DNA - substrat: dwuniciowe DNA lub hybrydy DNA:RNA, RNA:RNA - łączy pęknięcia w pojedynczych łańcuchach dwuniciowego DNA - może łączyć 2 fragmenty dsdna o tępych końcach (niska wydajność)

11 Łączenie DNA - Ligacja Aktywność ligazy Najczęściej wyrażana w jednostkach Weissa: 1 U = taka ilość enzymu która katalizuje przekształcenie 1 nmola 32 P-pirofosforanu w [γ,β- 32 P]ATP ciągu 20min. w 37 C jednostki Weissa ligazy liguje 50% fragmentów HindIII z 5ug bakteriofaga λ w ciągu 30min. w 16 C Optymalna temperatura ligacji: -16 C przez noc najwyższa efektywność - temp. pokojowa 30min - 2 hr do szybkiego klonowania - 4 C przez noc 24godz

12 Funkcje i zastosowanie: in vivo: udział w replikacji, rekombinacji i reperacji DNA in vitro: tworzenie nowych układów DNA i łączenie ich z wektorami podczas syntezy drugiej nici cdna (replacement synthesis) amplifikacja DNA znajdującego się na zewnątrz znanej sekwencji DNA inverse PCR detekcja mutacji punktowych w DNA za pomocą ligase chain reaction (ligase amplification reaction) Typy ligaz: zależne od ATP - T4 DNA ligase (podstawowa ligaza) zależne od NAD + - E.coli DNA ligase (replacement synthesis, nie liguje RNA, łączy tępe końce tylko w obecności PEGu lub Ficollu)

13 Ligacja fragmentów obcego DNA do wektorów plazmidowych Końce fragm. obcego DNA Tępe Lepkie różne, uzyskiwane przy pomocy różnych enz. restr. Lepkie identyczne, uzyskiwane przy pomocy tych samych enz. restr. Wymagania w klonowaniu Duże stężenie DNA i ligazy Otrzymanie maksymalnej wydajności ligacji wymaga oczyszczenia wektora po cięciu dwoma enzymami Liniowe DNA wektora trzeba traktować fosfatazą Uwagi tło klonów nierokombinantów może być wysokie możliwa eliminacja miejsc restrykcyjnych przy połączeniu wektora i obcego DNA możliwe tandemowe inserty tło klonów nierekombinantów niskie, miejsca restrykcyjne są zwykle zachowane możliwe tandemowe inserty obce DNA jest klonowane tylko w jednej orientacji miejsca restrykcyjne są zwykle zachowane możliwe tandemowe inserty obcy DNA może być wklonowany w każdej orientacji

14 Alkaliczna fosfataza AP 3 typy alkalicznej fosfatazy: BAP bacterial AP najbardziej aktywna najtrudniejsza do inaktywacji CIP calf intestinal AP inaktywacja prot.k lub 65C 1godz z 5mM EDTA SAP shrimp AP wrażliwa na temp. łatwa inaktywacja 65C przez 15 Katalizuje reakcję usunięcia grupy fosforanowej końca 5 DNA, RNA, rntps, dntps Alkaliczna fosfataza - zastosowanie Usuwanie grupy fosforanowej z końca 5 DNA lub RNA przed znakowaniem końców 32 P za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 Usuwanie grupy fosforanowej z końca 5 DNA by nie dochodziło do autoligacji (samozamykania się) DNA np. plazmidu

15 Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów α komplementacja / blue-white screening 2 nieaktywne fragmenty β-galaktozydazy łączą się tworząc aktywny enzym fragment genu kodujący pierwsze 146aa w plazmidach + miejsce klonowania bakteria na chromosomie 2 fragment genu enzym rozkłada X-gal kolonie są niebieskie Jeżeli dojdzie do wbudowania się insertu N terminalny fragment białka nie jest zdolny do komplementacji - nie ma aktywnej β-galaktozydazy kolonie są białe

16 Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów E.coli ccdb (control of cell death) białko CcdB blokuje gyrazę DNA (topoizomerazę II) która uczestniczy w naprawie DNA gdy komórka produkuje CcdB gyraza jest blokowana, komórka nie jest w stanie naprawić DNA i umiera - umieszczenie tego genu w MCS (miejscu do klonowania) powoduje że gdy insert się nie wbuduje dochodzi do wytworzenia białka CcdB i komórka posiadająca plazmid bez insertu umiera - obecność insertu w obszarze MCS powoduje przerwanie genu CcdB, gyraza nie jest blokowana, komórka normalnie rośnie

17 Przygotowanie i transformacja kompetentnych komórek E.coli Kompetencja do transformacji - stan komórki polegający na zdolności do absorbcji obcego DNA Metoda chemiczna (Heat shock) - metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca traktowaniu bakterii zimnym CaCl2 (na lodzie) i szybkim podgrzaniu do 42C Elektroporacja - metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca na odwracalnej destabilizacji błony komórkowej z wytworzeniem w niej porów, zachodzącej pod wpływem pola elektrycznego o wysokim napięciu.

18 TRANSFORMACJA - METODY Heat - shock komórki kompetentne - 0,1M CaCl 2 Elektroporacja komórki kompetentne w 10% glicerolu aparat do elektroporacji np. BIO-RAD + kuwety mieszanina ligacyjna + komórki kompetentne/ 20 0 o C mieszanina ligacyjne + kom. kompetentne /1 0 o C 1,5 42 o C =heat shock 5 lód (przerwanie reakcji) puls elektryczny ~5ms/ 1,5-1,8kV + 1 ml LB/ o C + 1 ml SOC / o C

19 Jaka jest i od czego zależy wydajność transformacji? transformowanych komórek na 1ug DNA plazmidowego szczepu bakterii (kompetencji= przygotowanie komórek) fazy wzrostu pobranych komórek ilości i wielkości DNA użytego do transformacji długości pulsu elektrycznego (heat shock u) jakości pożywki na jaką wysiewa się transformanty temperatury szybkości i sprawności wykonania