Metody analizy genomu

Transkrypt

1 Metody analizy genomu 1. Mapowanie restrykcyjne. 2. Sondy do rozpoznawania DNA 3. FISH 4. Odczytanie sekwencji DNA 5. Interpretacja sekwencji DNA genomu 6. Transkryptom 7. Proteom

2 1. Mapy restrykcyjne Były to pierwsze mapy molekularne. genomu Przykładem mapowania restrykcyjnego jest strawienie odcinka DNA dwoma enzymami osobno i razem. Poznajemy położenie i sekwencję miejsc restrykcyjnych, sekwencji pomiędzy nimi nie.

3 1. Mapy restrykcyjne Mapowanie restrykcyjne daje najlepsze wyniki dla stosunkowo krótkich odcinków DNA, poniżej 50 kb, bo większe odcinki się zlewają Gdy pozwolimy na pulsowanie pola elektrycznego, nawet tak długie odcinki jak 2Mb (małe chromosomy, fragmenty dużych, duże plazmidy, etc.) mogą być rozdzielone.

4 2. Sondy do rozpoznawania DNA - identyfikowanie genu na odcinku DNA Możemy mieć informację o interesującym nas genie, a nie znamy jego miejsca na chromosomie. Posiadana informacja może posłużyć do skonstruwanaia sondy (ang. probe), która odszuka ten gen. Sondy takie mogą być: - otrzymane na bazie badanego mrna, czyli są wyznakowanym cdna - wyznakowanymi fragmenty homologicznych genów znanych z innych organizmów - sztucznie zsyntetyzowane na podstawie sekwencji aminokwasów - białka: -aa aa aa aa Tyr Met His aa aa aa kodony TAC ATG CAC lub inne TAT CAT

5 2. Sondy do rozpoznawania DNA Technika bibułowa - blotting bibuła znacznik DNA i próbki elektroforeza Zaczęło się od omawianej wcześniej hybrydyzacji metodą Southerna. blot przeniesienie na filtr sondy odszukują sekwencje komplementarne błona fotograficzna

6 3. FISH (fluorescent in situ hibridization) - sonda wprost na chromosom Komórki z chromosomami w stadium metafazy denaturujemy chemicznie i prostujemy na płytce. Dodajemy sondę wyznakowaną fluorescencyjnie. Mapować można pod mikroskopem!!

7 3. FISH (fluorescent in situ hibridization) - sonda wprost na chromosom Na tym przykładzie widzimy chromosom metafazowy (para chromosomów homologicznych, każdy ma dwie chromatydy). Dodano tu na raz 18 różnych sond.

8 5. Odczytanie sekwencji DNA metoda Sangera (tradycyjna) Reakcja sekwencjonowania DNA polega na przerywanej syntezie DNA. Wśród normalnych nukleotydów znajduje się domieszka nukleotydów zmienionych tak, że uniemożliwiają one dalsze wydłużanie łańcucha. Te zmienione nukleotydy maja 4 markery fluorescencyjne: A, G, T, C. Tu przykład reakcji kończącej się na A, inne kończą się na G, T, C..

9 Mieszanina reakcji kończących się na A, G, T, C (z jednej matrycy DNA, długiej do 700 bp) jest rozdzielana w jednej kapilarze sekwenatora wyposażonego w odczyt fluorescencji

10 5. Odczytanie sekwencji DNA Dawniej rozdzielano i odczytywano na ogromnych żelach poliakrylamidowych Jeden nukleotyd daje widoczną róznice w tempie migracji

11 5. Odczytanie sekwencji CAŁEGO GENOMU Pewnym sposobem jest poznane wcześniej fizyczne porządkowanie kolekcji klonów i sekwencjonowanie jej elementów. Stworzenie takiej biblioteki jest jednak pracochłonne. Trzeba robić sondy z poszczególnych fragmentów i nimi szukać następnych, tak by się zazębiały.

12 Przykladem jest STS (sequence tagged site) mapping Potrzebnymi unikatowymi znacznikami (tutaj A-I) mogą być sondy zrobione z cdna genów mających jedna kopię w genomie. Możemy uporządkować naszą bibliotekę, czyli, zbudować kontig klonów.

13 5. Odczytanie sekwencji CAŁEGO GENOMU Metodą szybszą jest losowe wielokrotne losowe sekwencjonowanie fragmentów i numeryczne układanie ich w komputerze - tzw, metoda shutgun - nie wymaga fizycznego klonowania - obecnie zdecydowanie dominująca Widoczne pokrycie jest słabe, jak uzyskać setki fragmentów na danym odcinku?

14 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Na takich płytach rozprowadza się fragmenty DNA. Losowy fragment (kilkadziesiąt nukleotydów) ma wokół wolny promień około kilku mikronów. Pozwala to umieścić miliony różnych fragmentów na cm kwadratowym

15 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Pofragmentowane DNA (nawet cały genom na raz oczywiście w wielu kopiach) jest ligowane ze standardowymi starterami polimeryzacji

16 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Złączone fragmenty DNA i wolne startery są umieszczane na płycie. Losowy fragment (kilkadziesiąt nukleotydów) ma wokół wolny promień około kilku mikronów. Pozwala to umieścić miliony różnych fragmentów na cm kwadratowym.

17 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Mostkowanie fragment z dwoma starterami odnajduje starter komplementarny

18 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Replikacja do fragmentu dwuniciowego

19 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Rozdzielenie do dwóch pojedynczych nici

20 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Powtarzanie mostkowania i replikacji prowadzi do powstania plamek klonalnego DNA, do 1000 kopii w jednej plamce

21 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Dodawanie pierwszego nukleotydu warunkowo terminującego i podświetlenie w celu identyfikacji przyłączonego nukleotydu

22 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Identyfikacja pierwszego nulkeotydu

23 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Odblokowanie i odbarwienie pierwszego nukleotydu i dołączenie drugiego świecącego i blokującego nukleotydu

24 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Identyfikacja drugiego nukleotydu

25 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Wielokrotne powtarzanie identyfikacji

26 5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA analizator Solexa Złożenie sekwencji w kontig

27 6. Interpretacja sekwencji DNA czyli gdzie są geny? ORF (open reading frame) to każda sekwencja mająca na początku kodon START (ATG), dalej inne kodony aminokwasów, a kończąca się kodonem STOP (TAG, TGA, lub TAA). W sekwencji 4522 zasad są dwa prawdziwe geny kodujące białka (ciemne linie) i wiele fałszywych (jasne). Prawdziwe geny są odpowiednio długie i nie zachodzą na siebie (z pewnymi wyjątkami).

28 6. Interpretacja sekwencji DNA Poszukiwanie ORF jest utrudnione przez obecność intronów, szczególnie u wyższych eukariontów. W rozpoznaniu genów pomaga porównanie sekwencji DNA bliskich sobie gatunków.

29 5. Finałem jest podanie sekwencji i ADNOTACJI genów Celem mapowania fizycznego jest uzyskanie informacji, najlepiej z dokładnością co do jednej zasady, gdzie w genomie umiejscowiony jest interesujący nas element (gen, promotor, mutacja punktowa, profag, etc.) - poniżej przykład mapy chromosomu drożdży.

30 6) Transkryptom Transkryptom to ogół mrna obecnych w danym momencie w komórce. Nowoczesna technologia pozwala na badanie ekspresji wszystkich genów równocześnie! Sondy dla pojedynczych genów układa się w mikropanelach. Trzeba znać sekwencję badanych genów. Taki mikropanel jest następnie eksponowany na ekstrakt mrna uzyskany z genów ulegających ekspresji, a powstawanie hybryd wykrywa się laserem.

31 6) Transkryptom Celem badań ekspresji wszystkich genów jest charakterystyka zmian jakim ulega metabolizm komórki w różnych tkankach, warunkach środowiskowych, stanach chorobowych, etc.

32 6) Transkryptom Jeżeli badany jest jakieś zjawisko trwające w czasie, to można pobierać w zabiegu eksperymentalnym próbki mrna co pewien okres i uzyskać w ten sposób obraz podniesienia (zielono) lub obniżenia (czerwono) ekspresji poszczególnych genów w badanym czasie.

33 7. Proteom Proteom to ogół białek obecnych w komórce. Białka zawarte w komórce można rozdzielić w dwukierunkowej elektroforezie. Obrót Po wycięciu i oczyszczeniu z żelu białko poddawane jest spektrometrii masowej dla zidentyfikowania fragmentów (po strawieniu na odcinki 5-70 aminokw.) a potem ułożeniu ich w kontig sekwencji białka.

34 7. Proteom Chcielibyśmy znać nie tylko listę białek, ale też ich oddziaływania ze sobą. W systemie dwuhybrydowym, dwa dowolne białka (np. ludzkie) które podejrzewany o oddziaływanie łączymy z dwoma białkami drożdży.

35 7. Proteom Wykorzystujemy białka drożdży, które muszą się zbliżyć do siebie i dołączyć do odpowiednich miejsc przed genem reporterowym (np. barwnik) by uruchomić transkrypcję. To się udaje, jeśli sztucznie doczepione białka ludzkie oddziaływują ze sobą.

36 7. Proteom Efektem tych badań są sieci oddziaływań białek, pokazujące zwłaszcza te białka, które maja najwięcej partnerów.

37 7. Proteom Celem biologii systemów jest kompleksowy opis składu i oddziaływania ze sobą genów, transkryptów, białek i metabolitów w całej komórce, a nawet organizmie.