Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan

Transkrypt

1 Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan Klasyczna metoda PCR jest metodą jakościową, nie ilościową co np. w przypadku monitorowania zakażeń wirusowych jest jej dużą wadą. W technice tej ilość uzyskanego produktu zależy przede wszystkim od liczby przeprowadzonych cykli, od jakości i stężenia odczynników, warunków reakcji. W niewielkim stopniu zależy od wyjściowej liczby kopii matrycy. Teoretycznie ilość produktu po zakończeniu reakcji powinna być wykładniczo proporcjonalna do liczby matryc analizowanej sekwencji. W praktyce jednak występują duże różnice, dlatego do dokładnej analizy ilościowej opracowano technikę pozwalającą na monitorowanie ilości produktu PCR w każdym cyklu przeprowadzanej reakcji amplifikacji. Technikę tę nazwano reakcją łańcuchowej polimerazy DNA z analizą w czasie rzeczywistym, potocznie określa sie ją z angielskiego jako real-time PCR (rtpcr). Real-time PCR jest to PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) z analizą przyrostu ilości produktu po każdym cyklu amplifikacji (w tzw. czasie rzeczywistym). Ilość kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowana poprzez rejestrację sygnału fluorescencyjnego termocykler sprzężony jest z rejestratorem fluorymetrem. Liczba cykli reakcji PCR po których poziom fluorescencji przekroczy zdefiniowany próg (C T threshold cycle, moment wejścia kinetyki reakcji w fazę logarytmicznego przyrostu ilości produktu) jest stosowana do obliczenia liczby badanych cząsteczek (sekwencji) obecnych w mieszaninie na początku reakcji. PCR w czasie rzeczywistym pozwala na ilościowy pomiar DNA. Ilościowego pomiaru cząsteczek RNA można dokonać w sposób pośredni, tzn. przepisując sekwencję RNA na cdna za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy. W real-time PCR stosuje się odmianę reakcji PCR charakteryzującą się kilkoma cechami. Pierwsza to możliwość analizy produktów w czasie trwania reakcji (po każdym cyklu), a nie dopiero po jej zakończeniu. Inną zaletą jest miniaturyzacja testu i skrócony czas jej przebiegu. Technika ta nie wymaga rozdziału elektroforetycznego produktów PCR, co przynosi dodatkową oszczędność czasu i odczynników. Ponadto technika real-time PCR daje możliwość przeprowadzania multipleksowego PCR. Zazwyczaj stosuje się też standardowy profil termiczny startery projektuje się tak, aby przyłączały się w określonej temperaturze (zamiast dostosowywać temperaturę annealingu do sekwencji starterów). 1

2 Rysunek 1. Wykres zlogarytmowanych wartości fluorescencji w trakcie przebiegu PCR. W fazie ekspotencjalnego przyrostu wyraźnie widać różnice w ilości kopii badanej sekwencji pomiędzy próbami. W fazie plateau fluorescencja w każdej z prób osiąga podobną wartość. Rysunek 2 Wykres zlogarytmowanych wartości fluorescencji w trakcie przebiegu reakcji PCR z zaznaczoną linią progową threshold oraz wartością C T. Liczba cykli reakcji PCR po których poziom fluorescencji przekroczy zdefiniowany próg C T jest stosowana wnioskowania o liczbie badanych cząsteczek o określonej sekwencji obecnych w mieszaninie na początku reakcji. 2

3 Metoda real-time PCR, w zależności od źródła wzbudzanej fluorescencji, może być oparta o barwniki wiążące dwuniciowe DNA interkalujące (bromek etydyny, Sybr Green I) albo o znakowane barwnikami sondy DNA komplementarne do badanej sekwencji (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions). Genotypowanie (w przeciwieństwie do analizy ekspresji genów) w przypadku większości zmian w DNA, w tym polimorfizmów jednonukleotydowych (z ang. Single Nucleotide Polymorphism - SNP), jest badaniem jakościowym, a nie ilościowym w trakcie analizy nie jest oceniana ilość kopii danej sekwencji, a wykrywane są jej zmiany. Najczęściej stosowaną metodą genotypowania w oparciu o real-time PCR jest analiza fluorescencji pochodzącej ze swoistych sond DNA, hybrydyzujących jedynie do sekwencji odpowiadającej obecności badanego allela. Do najczęściej stosowanych sond molekularnych należą sondy hydrolizujące typu TaqMan. Sondy tego typu składają się z 2 części: pierwszej, zawierającej na końcu 5 fluorescencyjny barwnik reporterowy (zwykle oznaczany jako R z ang. reporter), drugą, na której końcu 3 znajduje się cząsteczka wyciszająca fluorescencję - wygaszacz (oznaczana jako Q z ang. quencher). Przed reakcją sonda nie emituje fluorescencji, gdyż jest ona pochłaniana przez wygaszacz. Sonda jest komplementarna do fragmentu sekwencji wyznaczonej przez startery (5 i 3 lub F ang. Forward i R ang. Reverse). W chwili przyłączenia sondy do komplementarnej matrycy DNA, barwnik fluorescencyjny fluoryzuje, jednak emitowane widmo jest absorbowane przez bliską obecność wygaszacza na zasadzie przeniesienia energii typu Förstera. Wydłużanie powielanej sekwencji przez polimerazę Taq (posiadająca aktywność nukleazową oprócz polimeryzacji DNA, tnie oligonukleotydy zhybrydyzowane do kopiowanej nici DNA) degraduje sondę, powodując odłączenie reportera od wygaszacza, a w konsekwencji wzrost fluorescencji, proporcjonalny do liczby powstających produktów PCR. Zestawy oparte na sondach TaqMan stosowane do genotypowania, zawierają parę starterów oraz dwie sondy (jedna komplementarna do sekwencji dzikiej, druga do sekwencji z mutacją, każda znakowana innym barwnikiem). Pomiar fluorescencji po zakończeniu reakcji wskazuje, która sonda była komplementarna do sekwencji DNA w badanej próbie i została pocięta, co pozwala na określenie genotypu. Jeśli obserwowana jest fluorescencja pochodząca z obu sond, dana próba zawiera obie sekwencje (heterozygota). Najnowsze aparaty do PCR w czasie rzeczywistym pozwalają na analizowanie bardzo małych próbek materiału, a ich czułość pozwala na wykrycie nawet jednej kopii DNA, co jest 3

4 szczególnie istotne w przypadku badań diagnostycznych, kryminalistycznych czy epidemiologicznych. Rysunek 3 Budowa sond Molecular Beacons i TaqMan Rysunek 4 Schemat działania sondy typu TaqMan w przebiegu genotypowania. W populacji 4

5 występują dwa allele (dwa warianty) badanej sekwencji w badanym polimorficznym locus może występować albo cytozyna (C), albo tymina (T). Do wykrycia tej zmiany, do mieszaniny reakcyjnej dodawane sa 2 sondy jedna komplementarna do sekwencji zawierającej C, druga do sekwencji z T w miejscu polimorficznym. Podczas PCR, do matrycy przyłącza się ta z sond, która jest w pełni komplementarna do analizowanej sekwencji, ulega hydrolizie ( pocięciu ) przez polimerazę, przez co barwnik reporterowi jest uwalniany i zaczyna świecić. Pomiar fluorescencji pozwala stwierdzić, który z sond została pocięta, co z kolei umożliwia ustalenie, który z alleli (C czy T) znajdował się w badanej próbie DNA. Do wykrywania SNPów można też zastosować strategię opartą o wykorzystanie barwników interkalujących nowej generacji (Sybr Green II, SYTO, EvaGreen). Metoda polega na bardzo precyzyjnej analiza profilu denaturacji (topnienia) uzyskanych produktów PCR i nosi nazwę HRM (z ang. high resolution melt). Podstawa metody jest fakt, że nawet zmiana pojedynczej zasady w sekwencji wykazuje możliwy do zmierzenia wpływ na temperaturę denaturacji amplikonu. Analizę topnienia przeprowadza się bezpośrednio po zakończeniu reakcji amplifikacji, stopniowo zwiększając temperaturę mieszaniny poreakcyjnej i mierząc poziom fluorescencji po każdej zmianie temperatury (zwykle co 0,1-0,5 o C). Podczas tego procesu dwuniciowe DNA ulega stopniowo topnieniu denaturacji (podwójna helisa DNA ulega rozpleceniu), co wiąże się ze spadkiem poziomu fluorescencji (barwnik interkalujący czy się jedynie z dwuniciowym DNA). Stopniowo zwiększając temperaturę, wraz z postępem denaturacji DNA (dsdna->ssdna) obserwuje się zanik fluorescencji. Obserwacje przedstawia się w postaci tzw. krzywej topnienia. W zależności od obecności/nieobecności badanych SNPów, profil topnienia (denaturacji rozpadu uzyskanego produktu PCR) jest różny. Metoda ta jest tańsza niż ta z użyciem sond typu TaqMan, ale wymaga precyzyjnej optymalizacji warunków PCR. Pozwala dość precyzyjnie rozróżnić heterozygoty od homozygot (ze względu na obecność w amplikonach heterozygotycznych tzw. heterodupleksów), ale nie zawsze jest dostatecznie precyzyjna, aby rozróżnić skrajne homozygoty: zmiana pary G-C na A-T powoduje dość znaczną zmianę w temperaturze denaturacji, ale niektóre zmiany sekwencji (np. A>T, T>A) w bardzo niewielkim stopniu wpływają na temperaturę topnienia amplikonu i są trudne do wykrycia tą metodą. 5

6 Rysunek 5 Analiza krzywej topnienia produktu reakcji PCR zależność pochodnej zmiany fluorescencji danego SNP od temperatury. Poszczególne kolory oznaczają próby o innym genotypie (dwie homozygoty różne i heterozygoty) Rysunek. 6. Homo- i heterodupleksy DNA. Jeśli analizowana próbka DNA jest homozygotą (identyczna sekwencja na obu chromosomach z pary), produkt PCR będzie zawierał jedynie homodupleksy jednego typu. Jeśli jednak w analizowanym locus na jednym chromosomie w miejscu polimorficznym jest inna zasada niż na drugim, produkt PCR będzie mieszaniną obu wariantów. Po renaturacji produktu PCR część nici z obu wariantów wymiesza się i powstaną heterodupleksy, fragmenty DNA o niepełnej komplemetarności, a przez to niższej temperaturze topnienia. Produkt PCR w przypadku heterozygot jest więc mieszaniną obu homodupleksów i heterodupleksów. 6