ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) Celem ćwiczenia jest wprowadzenie mutacji punktowej do genu blgb: zamiana kodonu dla waliny (Val) w pozycji 92 na fenyloalaninę (Phe) oraz wprowadzenie miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych: Nde I i Kpn I, odpowiednio na początku i końcu genu. Schemat reakcji OE-PCR (ang. overlap extension PCR). 1

2 Materiały: Wektor: blgb_pma-t (2,8 kbp) wektor zawierający niezmodyfikowany gen blgb (matryca do reakcji PCR) Startery: blgb V92F FOR (50 μm) blgb V92F REV (50 μm) blgb NdeI FOR (50 μm) blgb KpnI REV (50 μm) Odczynniki: termostablina polimeraza Pfu dntp (mix, 10 mm) mieszanina deoksynukleotydów sterylna woda destylowana standard do elektroforezy DNA GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific) bufor obciążający do elektroforezy DNA (0.25% błękit bromofenolowy, 30% glicerol) agaroza Basica LE (Prona) Wykonanie ćwiczenia: 1. przygotować mieszaniny do dwóch reakcji PCR: PCR 1 i PCR 2: reakcja PCR 1 woda destylowana 36,0 μl matryca DNA (blgb_pma-t) (100 ng/ μl) blgb NdeI FOR (50 μm) blgb V92F REV (50 μm) dntp (10 mm, mix) polimeraza Pfu (2,5 U/μl) reakcja PCR 2 woda destylowana 36,0 μl matryca DNA (blgb_pma-t) (100 ng/ μl) blgb V92F FOR (50 μm) blgb KpnI REV (50 μm) dntp (10 mm, mix) polimeraza Pfu (2,5 U/μl) 2

3 2. zaprogramować termocykler T100 (Bio-Rad) według poniższego schematu: a. denaturacja wstępna 95 C 3 min. 1 cykl; b. denaturacja 95 C 30 s c. hybrydyzacja starterów 45 C 30 s 25 cykli d. wydłużanie 72 C 30 s e. zakończenie 72 C 5 min. f. inkubacja 4 C - 3. przygotować żel agarozowy do rozdziału elektroforetycznego produktów PCR: 2 g agarozy rozpuścić w 100 ml buforu 1 x TAE (0.04 M Tris HCl ph 8.0, 0.04 M kwas octowy 99,9% (lodowaty), 1 mm EDTA) w mikrofalówce, ostudzić, wylać, dodać 3.0 μl Midori Green DNA Stain (NIPPON Genetics EUROPE GmbH), wymieszać i pozostawić do zastygnięcia; 4. po zakończonym PCR, do każdej z próbek dodać 10 μl buforu obciążającego do elektroforezy DNA, wymieszać i nałożyć na żel. Nałożyć również standard DNA (5 μl) GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder; włączyć zasilacz, usatwić napięcie 90V; prowadzić elektroforezę przez ok. 30 min.; 5. w trakcie trwania elektroforezy DNA włączyć termoblok, ustawić na temperaturę grzania 60 C; 6. po zakończonej elektroforezie zrobić zdjęcie żelu, zidentyfikować właściwe produkty PCR, a następnie korzystając z transiluminatora wyciąć odpowiednie prążki; 7. wycięte prążki zawierające produkty PCR umieścić w 1.5 ml probówkach i przeprowadzić izolację DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu GeneElute Gel Extraction Kit (Sigma- Aldrich) na podstawie instrukcji dostarczonej przez prowadzącego; 8. po zakończonej izolacji probówki z oczyszczonymi produktami PCR podpisać i zamrozić; ciąg dalszy nastąpi na ćwiczeniu nr 2; 9. przygotować mieszaninę do trzeciej reakcji PCR (PCR 3): reakcja PCR 3 woda destylowana x μl produkt PCR 1 (V92F-KpnI) x μl produkt PCR 2 (NdeI-V92F) x μl blgb NdeI FOR (50 μm) blgb KpnI REV (50 μm) dntp (10 mm, mix) polimeraza Pfu (2,5 U/μl) 10. przeprowadzić PCR wg programu z punktu 2; 11. rozdzielić produkty PCR na żelu agarozowym (patrz pkt. 3, 4); 12. wyizolować produkty PCR analogicznie jak na ćw. nr 1; po izolacji produkty PCR zamrozić na kolejne ćwiczenia. 3

4 W sprawozdaniu (sprawozdanie będzie obejmować materiał z ćwiczeń 1, 2, 3): A) proszę zaprojektować startery umożliwiające wprowadzenie mutacji (zamiana aminokwasu waliny w pozycji 92 na fenyloalaninę) oraz miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych (dla enzymu Nde I na początku genu oraz Kpn I na końcu genu wołowej beta-laktoglobuliny), proszę podać sekwencje starterów, ich długość, procentową zawartość par GC oraz temperaturę topnienia. Jeżeli przy projektowaniu starterów zostanie wykorzystana jakaś literatura lub programy komputerowe, proszę wymienić je w bibliografii. Przy projektowaniu starterów można skorzystać z materiałów pomocniczych załączonych do sprawozdania. B) proszę zamieścić właściwie opisane zdjęcia produktów PCR i zaznaczyć, które prążki odpowiadały właściwym produktom PCR; C) proszę wymienić i krótko opisać czynniki mające wpływ na szybkość rozdziału DNA w żelach agarozowych. UWAGA! Sprawozdanie powinno zostać oddane po ćwiczeniu nr 3 Sprawozdanie powinno zawierać: krótko sformułowany cel ćwiczenia; właściwie opisane wyniki eksperymentów; odpowiedzi na zagadnienia odnoszące się do danego ćwiczenia. Proszę nie umieszczać w sprawozdaniu: wstępu teoretycznego; opisu wykonania ćwiczenia. 4

5 MATERIAŁY POMOCNICZE SCHEMAT WEKTORA EKSPRESYJNEGO petduet-1 5

6 SEKWENCJA NUKLEOTYDOWA GENU blgb ATGCTGATTGTTACCCAGACCATGAAAGGTCTGGATATTCAGAAAGTTGCAGGCACCT GGTATAGCCTGGCAATGGCAGCAAGCGATATTAGCCTGCTGGATGCACAGAGCGCACC GCTGCGTGTTTATG TTGAAGAACT GAAACCGACA CCGGAAGGTGATCTG GAAAT TCTGCTGCAGAAATGGGAAA ATGGTGAATG TGCCCAGAAA AAAATCATTG CCGAAAAAAC CAAAATTCCGGCAGTGTTTA AAATCGATGC CCTGAATGAAAACAA AGTTCTGGTTCTGGACACCGATTACAAAAAATACC TGCTGTTCTG CATGGAAAAT AGCGCAGAAC CGGAACAGAG CCTGGCATGTCAGTGTCTGG TTCGTACACCGGAA GTTGAT GATGAAGCAC TGGAAAAATT CGACAAAGCACTGAAAGCCCTGCATGCC GA TATTCGTCTG AGCTTTAATC CGACCCAGCT GGAAGAACAGTGCCATATCTAA GTT- kodon kodujący walinę w pozycji 92 ATG i TAA kodony start i stop SEKWENCJE ROZPOZNAWANE PRZEZ ENZYMY RESTRYKCYJNE Nde I 5`-CA^TATG-3` Kpn I 5`-GGTAC^C-3` 6

7 TABELA KODU GENETYCZNEGO 7