Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy

Transkrypt

1 Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy

2 Ligazy Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami 3 OH i 5 PO 4 w kwasach nukleinowych DNA lub RNA. W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD + lub ATP w zależności od typu ligazy. Funkcja in vivo: udział w replikacji opóźnionego pasma DNA, rekombinacja genetyczna, naprawa DNA Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej: Rekombinacja DNA in vitro łączenie cząsteczek kwasów nukleinowych lepkich lub tępych końców oraz szereg innych bardzo specyficznych zastosowań.

3 Własności ligaz używanych w rekombinacji in vitro Ligazy Substraty kofaktory temperatura lepkie tępe końce DNA-RNA RNA-RNA E.coli tak tak* nie nie NAD + Mg 2+ (1-3 mm) C T4 faga tak tak* tak* tak* ATP Mg 2+ (10 mm) 4 C C Bakterii termofilnych tak nie nie nie NAD + Mg 2+ (10 mm) C Ligacja tępych końców jest znacznie mniej efektywna

4 Fosfataza alkaliczna Usuwa 5 -fosforan z ssdna, dsdna i RNA, rntp i dntp. Metaloenzym (Zn II) Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna na ogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcję defosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris ph w obecności niskich stężeń Zn +2 (poniżej 1 mm). Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP calf intestinal alkaline phosphatase) mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C 30 min lub 75 C 10 min) w obecności 10 mm EDTA. Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP shrimp alkaline phosphatase) aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C 15 min (zalecane 70 C 20 min).

5 Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej: defosforylacja tj. usuwanie 5 fosforanów z wektorów trawionych enzymami restrykcyjnymi jeżeli DNA wektora zostało strawione jednym enzymem restrykcyjnym defosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bez wstawki traktowanie DNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowania

6 Polimerazy DNA Polimerazy są enzymami, których główną funkcją jest kataliza tworzenia polimerów kwasów nukleinowych RNA i DNA na matrycy istniejących jednoniciowych DNA lub RNA. Proces ten to polimeryzacja. Polimeraza I polimeraza Kornberga (m.cz. 109 kd) Odkryta w 1958 r. Kodowana przez gen pola. Funkcja in vivo: enzym naprawczy Średnia szybkość polimeryzacji 20 nukleotydów/sec, Struktura krystaliczna Taq DNA polimerazy niska procesywność nukleotydów, 400 cząstek na komórkę. 1. Aktywność: 5 3 polimeryzacja DNA Substrat: jednoniciowe DNA i starter z wolną grupą 3 OH. Reakcja: DNA OH DNA- ( p dn) n +PP Wymagania: Mg +2 datp, dttp, dgtp, dctp

7 2. Aktywność: 3 5 egzonukleolityczna-sprawdzająca Substrat: dsdna lub ssdna z wolnym 3 OH końcem. Degraduje DNA od 3 OH. Ta aktywność na dsdna jest blokowana przez aktywność polimeryzacyjną 5 3. Reakcja: dsdna lub ssdna 5 p dn OH Wymagania: Mg Aktywność: 5 3 egzonukleolityczna Substrat: dsdna lub RNA-DNA hybrydy. Degraduje dsdna od 5 końca; degraduje RNA w hybrydzie z DNA - aktywność RNAzy H Wymagania: Mg +2

8 Zasosowanie polimerazy I (holoenzymu) 1. Znakowanie DNA przez przesunięcie przerwy (nick-translation). Tylko ta polimeraza może przeprowadzać tę reakcję ze względu na aktywność egzonukleazy 5 3

9 Fragment Klenowa DNA polimerazy I polimeraza I pozbawiona N-końcowej domeny stanowi tzw. fragment Klenowa. Polimeraza 3 5 egzo- 5 3 egzo (46 kd) nukleaza (22 KD) nukleaza C N Fragment Klenowa (605 aa)

10 Zastosowanie polimerazy Klenowa: 1. Synteza dsdna na matrycy ssdna: Warunki reakcji: matryca ssdna, startery - oligonukleotydy 6-20 n komplementarne do określonego fragmentu DNA z wolną grupą OH, bufor, dntps, Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub znakowanych innymi markerami.

11 2. Wypełnianie cofniętych 3 - końców we fragmentach DNA (fill-in reaction): Stosuje się w celu tworzenia tępych końców we fragmentach powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 5 -wystające końce. 3 Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub znakowanych innymi markerami.

12 3. Wytrawianie wystających 3 końców: Stosuje się również w celu tworzenia tępych końców we fragmentach powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 3 -wystające końce. Aktywność egzonukleazowa 3 5 polimerazy Klenowa wytrawia wystające nadmierności.

13 DNA polimeraza bakteriofaga T7 zawiera dwie podjednostki, o aktywnościach takich samych jak polimeraza Klenowa. Szczególnie użyteczna ponieważ charakteryzuje się znacznie większą procesywnością i wysoką wiernością (~1000 x większą niż polimeraza Klenowa). Używana jest do sekwencjonowania DNA metodą Sangera, także pod nazwą Sequenase lub Sequenase 2.0 (bez aktywności 3 5 egzonukleolitycznej w wyniku delecji 28 aa w N-końcu enzymu)

14 DNA-zależna polimeraza DNA Termostabilne DNA polimerazy - mają podobne aktywności jak polimeraza I, ale maksymalną aktywność katalityczną wykazują w C (Taq polimeraza ma tylko 10% maks. aktywności w 37 C). -szybkość reakcji w optymalnej temp. 150 dntp/sec/cząsteczkę enzymu. Polimeraza 3 5 egzo- Żródło i własności nukleaza Taq nie Termus aquaticus. Okres półtrwania 95 C h; wierność 1x x10 5 ; procesywność: 42 n Pfu tak Pyrococcus furiosus. Największa wierność: 1.5x10-6 Vent tak Thermococcus litoralis. Okres półtrwania 95 C - 7 h; wierność pośrednia Zastosowanie termostabilnych polimeraz: Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) w różnych odmianach.

15 Odwrotna transkryptaza RNA-zależna polimeraza DNA Obecna w retrowirusach, gdzie kopiuje wirusowe RNA przed integracją do genomu. Ma dwie aktywności: -RNA zależnej DNA polimerazy w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje DNA na matrycy ssrna i ssdna z jednakową wydajnością. W obu przypadkach wymaga startera RNA lub DNA. Nie ma aktywności 3 5 egzonukleazy (1/500 n jest błędny). - Rnazy H - jest rybonukleazą, która degraduje RNA z RNA-DNA hybrydów. Funkcjonuje zarówno jako endo- i egzonukleaza. Najczęściej wykorzystuje się dwa różne enzymy z wirusa mysiej białaczki Moloneya z wirusa ptasiej mieloblastozy. uzyskiwane albo przez oczyszczanie z wirusa, albo jako białka rekombinowane w E. coli.

16 Zastosowanie odwrotnej transkryptazy: 1. Kopiowanie RNA na DNA np. podczas klonowania eukariotycznych genów, w kiedy używa się mrna jako matrycy w syntezie cdna. Funkcję starterów pełnią wówczas krótkie n polimery (oligo dt), komplementarne z ogonkami polia mrna. starter odwrotna transkryptaza 2. Tworzenie kopii DNA z RNA przed amplifikacją PCR, w reakcji zwanej RT-PCR. Reakcja ta jest stosowana w klonowaniu cdna czy diagnostyce chorób głównie zakaźnych (wirusowych). W tym wypadku stosuje się albo startery o przypadkowej sekwencji, albo jeśli sekwencja jest znana, startery o określonej sekwencji.

17 Terminalna transferaza Katalizuje dodawanie nukleotydów dntp do 3 OH końca DNA. Działa na ssdna, dsdna z wystającymi końcami (preferuje wystający koniec 3 ) i mniej efektywnie z tępymi końcami. Terminalna transferaza jest ludzkim enzymem, syntetyzowanym w limfocytach. W laboratoriach używa się enzymu izolowanego z bakterii E. coli transformowanych genem wołu Jest to jedyna polimeraza, która nie wymaga startera i matrycy. W odpowiednich warunkach terminalna transferaza może dodać wiele tysięcy dntp lub tylko jeden nukleotyd jeśli jest odpowiednio zmodyfikowany np. ddntp Zastosowanie: 1. Znakowanie 3 końców DNA: substratem w tej reakcji są fragmenty uzyskane po trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi 3 końce lub oligonukleotydy. Jeśli taki DNA jest inkubowany w obecności znakowanych nukleotydów i terminalnej transferazy do jego końca 3 zostanie dodany szereg nukleotydów obecnych w mieszaninie reakcyjnej a DNA zostanie wyznakowany. 3 3

18 2. Dodawanie komplementarnych homopolimerowych ogonków do DNA: Stosowany np. do klonowania cdna do plazmidów. Terminalna transferaza pozwala na tworzenie homopolimerowych ogonków komplementarnych do siebie w liniowych fragmentach DNA.

19 Kinaza polinukleotydowa (PNK) PNK jest enzymem, który katalizuje przeniesienie - fosforanu z ATP na 5 koniec DNA lub RNA. Najczęściej stosuje się rekombinowany enzym faga T4 nadprodukowany w E. coli. Zwykle są stosowane dwa typy reakcji : forward - w której - fosforan z ATP jest przenoszony na 5 koniec defosforylowanego DNA. W reakcji wymiany exchange, w obecności nadmiaru ADP, PNK przenosi terminalny fosforan z ufosforylowanego DNA na ADP i ponownie przenosi radioaktywny - fosforan z [ - 32 P] ATP. Reakcja typu wymiany jest mniej wydajna. Zastosowanie: głównie znakowanie np. radioaktywne cząsteczek DNA używanych jako sond w hybrydyzacji oraz fosforylacja (dodawanie 5 -fosforanów) do wszelkich cząsteczek, które ich nie posiadają np. linkerów, adapterów, starterów

20 DNazy i RNazy Nukleazy (inne niż ER) Dzielą się na endo- i egzonukleazy. Ich specyficzność substratowa zależy wyłącznie od stężenia enzymu im większe stężenie tym niższa specyficzność. Dnazy 1. DNaza I - endonukleaza, tnie dsdna i ssdna preferencyjnie w sąsiedztwie C lub T tworząc 5 -fosforylowane di-, tri-, i tetranukleotydy. Nie trawi RNA Zastosowanie: 1. Usuwanie DNA z preparatów RNA; 2. Analiza interakcji DNA-białko (tzw. footprinting); 3. Nadtrawianie DNA w reakcji przesunięcia przerwy RNazy 1. Rybonukleaza A endorybonukleaza, trawi ssrna w 3 końcu reszty pirymidynowej Degraduje RNA do 3 ufosforylowanych mono- i oligonukleotydów Zastosowanie rybonukleaz: 1. Usuwanie kontaminacji RNA w preparatach plazmidowego DNA