PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) C12N 15/29 ( ) C12N 15/11 ( ) (54) Sposób wykrywania obecności genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1 w materiale genetycznym owsa zwyczajnego oraz para starterów do wykrywania obecności genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 04/14 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/15 (72) Twórca(y) wynalazku: SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest molekularny marker genetyczny pozwalający na identyfikację obecności genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1 w genomie roślin owsa oraz sposób jego detekcji w łańcuchowej reakcji polimerazy. Z opisu zgłoszeniowego wynalazku nr PL A1 znana jest sekwencja oligonukleotydowych starterów specyficznych dla terminalnych rejonów markerowego fragmentu DNA oraz sposób identyfikacji tego markera w materiale genetycznym pszenżyta. Sposób polega na tym, że w łańcuchowej reakcji polimerazy powiela się markerowy fragment DNA sprzężony z nowym genem karłowatości pszenżyta z zastosowaniem pary starterów specyficznych, co pozwala na identyfikację obecności badanego genu w roślinach na wczesnych etapach ich rozwoju i niezależnie od wpływu środowiska. Opracowanie specyficznych markerów, które pozwolą w szybki sposób przeprowadzić identyfikację pożądanych genotypów jest bardzo ważne z punktu widzenia hodowlanego. Dotychczas w hodowli owsa zwyczajnego nie stosowano zbliżonych rozwiązań, natomiast w hodowli pszenżyta wykorzystywano geny karłowatości pochodzące od pszenicy (Rht-B1b, Rht-D1b, Rht-D1c oraz Rht-B1c) oraz od żyta (Dw1). Spośród w/w genów markery DNA w systemie analogicznym do zastosowanego w wynalazku znane są dla genów Rht-B1b i Rht-D1b (Ellis M.H., Spielmeyer W., Gale K.R., Rebetzke G.J., Richards R.A Perfect markers for the Rht-B1b and Rht-D1b dwarfing genes in wheat. Heredity 35: ). Poza znanymi i scharakteryzowanymi dotąd genami karłowatości pszenżyta w roślinach mogą pojawiać się także inne geny powodujące skrócenie źdźbła. Najczęściej są one wynikiem spontanicznych mutacji w genomie. Najnowszy gen tego rodzaju został zidentyfikowany w 2008 roku w Rosji. Powodował on redukcję wysokości roślin pszenżyta o około cm (Kurkiev K.U Inheritance of plant height in hexaploid triticales with R/D substitution. Russ. J. Genet. 44(9): ). Obecność genu będącego wynikiem spontanicznej mutacji zidentyfikowali w badanym materiale również współtwórcy wynalazku. Największym problemem związanym z możliwością zastosowania tego rodzaju nowych źródeł karłowatości w praktycznej hodowli roślin jest brak szybkich i pewnych metod ich identyfikacji. Z tego względu opracowany został niniejszy wynalazek. Sposób wykrywania obecności nowego genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1 w materiale genetycznym owsa zwyczajnego polega na tym, że polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary specyficznych starterów oligonukleotydowych, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji. Przedmiot wynalazku stanowi także para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: BG10F1: BG10R1: 5 -ACACGGCTCTCTGCCTTCTA-3 5 -AATTTTAGAATTGTGAGTGTGTTGAT-3. W łańcuchowej reakcji polimerazy w określonych warunkach, według wynalazku zastosowane startery amplifikują fragment DNA o długości 592 par zasad i sekwencji. Podstawową zaletą opracowanego systemu identyfikacji jest możliwość analizy roślin w bardzo wczesnym stadium rozwoju, a wynik uzyskiwany jest w krótkim czasie i jest niezależny od warunków środowiska wzrostu i rozwoju rośliny. W procesie identyfikacji materiał badań stanowi genomowy kwas deoksyrybonukleinowy (DNA), wyizolowany z roślin owsa zwyczajnego. Uzyskaną próbkę DNA wykorzystuje się w ilości 60 ng jako matrycę w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Poza matrycowym DNA, w skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą następujące składniki w podanych stężeniach: bufor do PCR (1x), mieszanina deoksynukleozydotrifosforanów dntp (0,1 mm), kofaktor polimerazy w postaci jonów Mg 2+ (1,5 mm), para podanych specyficznych starterów oligonukleotydowych (5 pmol każdy) oraz enzym polimeraza Taq (1U). Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 l. Przygotowane próbki umieszcza się w bloku termocyklera i przeprowadza reakcję amplifikacji stosując podany profil termiczny: wstępna denaturacja w temperaturze 94 C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli: denaturacja w 94 C przez 45 sekund, przyłączanie starterów w 54 C przez 45 sekund, wydłużanie produktów w temperaturze 72 C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72 C przez 7 minut.

3 PL B1 3 Próbki bezpośrednio po łańcuchowej reakcji polimerazy kieruje się do detekcji obecności oczekiwanego produktu o długości 592 par zasad za pomocą dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych. Obecność produktu o długości 592 par zasad, stanowiącego marker, w badanym materiale świadczy o występowaniu genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1. Sposób identyfikacji nowego genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1 w genomie owsa zwyczajnego według wynalazku ilustruje poniższy przykład, zaś na rysunku przedstawiono sekwencję markerowego, polimorficznego fragmentu DNA amplifikowanego w PCR z zastosowaniem pary starterów BG10F1 i BG10R1. P r z y k ł a d A. Izolacja DNA z roślin owsa zwyczajnego Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu GeneMATRIX Plant & Fungi DNA Purification Kit (EURz). Pierwszym etapem izolacji była homogenizacja tkanki roślinnej w ciekłym azocie. Do homogenizatu dodano 400 l buforu LyseP i dokładnie zawieszono rozdrobnioną tkankę w buforze. Do zawiesiny rozdrobnionej tkanki dodano 3 l Rnase A i 10 l Proteinase K i dokładnie wymieszano przez worteksowanie. Następnie probówki z mieszaniną umieszczono w termobloku w 65 C na 30 minut. W czasie inkubacji probówki dwukrotnie wymieszano przez worteksowanie. Po zakończonej inkubacji do każdej probówki dodano 130 l buforu AC i dokładnie wymieszano przez odwracanie. Następnie, mieszaninę inkubowano w lodzie przez 5 minut i wirowano 10 minut z prędkością rpm. Z każdej probówki zebrano ostrożnie 400 l supernatantu i przeniesiono do nowych probówek. Do supernatantu dodano 350 l buforu Sol P i 250 l 96% etanolu i delikatnie wymieszano przez odwracanie i wirowano przez 1 minutę z prędkością rpm. Następnie z każdej probówki pobrano po 600 l supernatantu i przeniesiono aktywowane wcześniej kolumny znajdujące się w probówkach odbierających. Kolumny wirowano przez 1 minutę z prędkością rpm, z probówek odbierających wylano przesącz i naniesiono na kolumny pozostałą część supernatantu. Kolumny ponownie zwirowano w tych samych warunkach. Po wylaniu przesączu na kolumny naniesiono 500 l buforu płuczącego Wash PX i wirowano przez 1 minutę przy rpm. Ponownie wylano przesącz i powtórzono płukanie kolumny buforem Wash PX. Kolumny wirowano przez 2 minuty z prędkością rpm. Następnie, kolumny umieszczono w nowych probówkach typu Eppendorf i dodano 100 l ogrzanego do 70 C buforu Elution. Kolumny pozostawiono na 3 minuty w temperaturze pokojowej a następnie wirowano przez 1 minutę z prędkością rpm. Stężenie DNA oceniono na żelu agarozowym porównując z wzorcem masy Low DNA Mass Ladder (Gibco) oraz za pomocą spektrofotometru SmartSpecTM (Bio-Rad). Stężenie wszystkich prób doprowadzono do jednakowego stężenia 200 ng/ l. B. Przygotowanie próbek do PCR Wyizolowane DNA doprowadzono do roboczego stężenia 20 ng/ l i tak przygotowane stosowano jako matrycę w łańcuchowej reakcji polimerazy. Do każdej probówki o pojemności 0,2 ml nanoszono po 60 ng matrycy. Pozostałe składniki reakcji połączono na lodzie w mix zawierający: 1x bufor do PCR (10 mm Tris ph 8,8; 50 mm KCl; 0,08% Nonidet P40), mieszaninę deoksynukleozydotrifosforanów o stężeniu 0,1 mm, kofaktor polimerazy w postaci dwudodatnich jonów magnezu o stężeniu 1,5 mm, parę specyficznych starterów oligonukleotydowych w ilości 5 pmol każdy oraz enzym polimerazę w stężeniu 1U. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 l. Reakcję przeprowadzono w termocyklerze stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja w temperaturze 94 C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli: denaturacja: 94 C przez 45 sekund, przyłączanie starterów: 54 C przez 45 sekund, wydłużanie produktów w temperaturze 72 C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72 C przez 7 minut. C. Elektroforeza agarozowa przeprowadzona w celu wizualizacji wyników PCR Po reakcji, do każdej probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną dodano 3 l buforu obciążającego i naniesiono na 1,5% żel agarozowy, zawierający 0,01 bromku etydyny. Rozdział przeprowadzono w buforze 1x TBE przez 1,5 godziny przy napięciu 120 V. Wizualizacji wyników dokonano podświetlając żel światłem UV, a do archiwizacji zastosowano cyfrowy aparat fotograficzny.

4 4 PL B1

5 PL B1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji. 2. Sposób wykrywania obecności genu odporności na mączniaka prawdziwego OMR1 w materiale genetycznym owsa zwyczajnego, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w wyniku PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 592 par zasad o sekwencji nr 3 przedstawionej na liście sekwencji.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)