Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych

Transkrypt

1 Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych Wstęp teoretyczny Technika RAPD (ang. Random Amplification of Polymorphic DNA) opiera się na prostej reakcji PCR, przeprowadzanej na genomowym DNA drobnoustrojów z zastosowaniem jednego startera, bądź kombinacji dwóch lub wielu starterów w zależności od potencjału różnicującego metody. Startery te zapoczątkowują amplifikację fragmentów DNA w różnych regionach genomu jednocześnie. Do reakcji PCR wybiera się starter o dowolnej, często losowej sekwencji, o długości od 10 do 20 pz. Starter przyłącza się do obu nici matrycowego DNA. Warunkiem zajścia prawidłowej, wydajnej amplifikacji fragmentów DNA konieczne jest, aby (rys.1): startery dołączone do obu nici były względem siebie w odpowiedniej orientacji odległość pomiędzy starterami nie przekraczała pz ze względu na procesywność stosowanych polimeraz DNA oraz możliwości rozdziału w 6-8% żelu poliakryloamidowym. Rys. 1 Schemat techniki RAPD. Amplifikacji ulega fragment ograniczony starterami przyłączonymi w miejscu 3 i 4. Pomiędzy starterami przyłączonymi w miejscu 2 i 4 jest zbyt duża odległośd do wydajnej amplifikacji, natomiast startery w miejscach 1 i 2 są przyłączone w niewłaściwej orientacji. W metodzie RAPD reakcję PCR w kilku pierwszych cyklach (od 3 do 5) często prowadzi się przy obniżonej temperaturze przyłączania starterów (ok C), aby umożliwić hybrydyzację startera do miejsc nie w pełni komplementarnych, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo amplifikacji fragmentów DNA. W kolejnych 30 cyklach stosuje się już wyższą (50-55 C) temperaturę przyłączania, właściwą dla wybranego startera, wyznaczoną na podstawie teoretycznie obliczonej temperatury topnienia.

2 Uzyskane w reakcji PCR produkty rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym uzyskując charakterystyczne dla badanego szczepu bakterii profile prążków. Porównanie profili pozwala wyznaczyć poziom podobieństwa pomiędzy badanymi szczepami. Ze względu na niską specyficzność przyłączania starterów do matrycowego DNA, technikę RAPD charakteryzuje niski stopień powtarzalności. Cechy metody RAPD Tabela 1 Specyficzność Poziom dyskryminacji Poziom Metoda uniwersalna, nie wymaga znajomości sekwencji genomowego DNA, wymaga stosowania czystych kultur bakteryjnych Wysoki, zależy jednak od długości i sekwencji startera/ów, Metoda bada polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów Możliwość regulacji poziomu Brak możliwości regulacji poziomu specyficzności Możliwość regulacji poziomu dyskryminacji poprzez dobór ilości starterów w reakcji PCR oraz obniżenie lub podwyższenie temperatury przyłączania starterów

3 Ćwiczenie Wybór układu do różnicowania mikroorganizmów metodą RAPD Aby różnicować szczepy bakteryjne metodą RAPD, należy w pierwszej kolejności wybrać układ starterów do reakcji PCR, w zależności od oczekiwanego poziomu dyskryminacji. Zadaniem każdej grupy jest przeprowadzenie analizy dla jednego gatunku bakterii z zastosowaniem różnej kombinacji starterów. Na podstawie uzyskanych wyników należy wybrać jeden układ, o najwyższym potencjale różnicującym. Cel ćwiczenia Dobór układu do różnicowania wybranych szczepów bakterii za pomocą metody RAPD. Materiały 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mm roztwór MgCl 2, 8 mm mieszanina dntps startery 1247 (AAGAGCCCGT); 1290 (GTGGATGCGA); 400 (GCTGGCGACGTTGCGCCG); Baeza (GGTGCGGGAA); starter A08 (GTGACGTAGC); OPK 20 (GTGTCGCGAG); OP107 CAGCGACAAG, polimeraza DNA termostabilna Pwo [2U/µl] woda jałowa, agaroza, bufor 1xTEA, termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok, statywy do probówek szczepy bakteryjne wg tabeli 1 Szczepy bakteryjne Tabela 2 Lp Gatunek Oznaczenie 1 Escherichia coli Ec 1 2 Escherichia coli Ec 2 3 Escherichia coli Ec 3 Wykonanie 1. Przygotować 4 probówek 0,2 ml, opisać odpowiednio 1-3 dla szczepów badanych, K- dla kontroli ujemnej.

4 2. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX wg tabeli 2, zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA, zastosować kombinację dwóch dowolnych starterów (każda grupa inny układ), wymieszać i rozporcjować po 24µl. Skład mieszaniny reakcyjnej Tabela 3 Profil temperaturowo czasowy Skład x1 Master MIX (x5) Ilość [µl] 1-3 K- Temper atura [ C] Czas [s] Liczba cykli Woda 1) 10 x bufor Shark 2, MgCl 2 [20 mm] 2, dntps [8 mm] 2, Starter 1 [10µM] 1, Starter 2 [10µM] 1, Starter 3 [10µM] 1, Polimeraza Pwo [2U/µl] 0, DNA 1,0 X 1,0-4 Woda X - 1,0 Objetość całkowita Do probówek oznaczonych od 1 do 3 dodać po 1µl genomowego DNA badanych szczepów, do K- dodać 1µl wody. 4. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo czasowym, przedstawionym w tabeli Produkty PCR rozdzielać w 6% żelu poliakryloamidowym w buforze 1xTBE przy napięciu ok. 170 V. Żel wybarwić i analizować w świetle UV. Wyniki i wnioski: 1. Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, próby badane oraz kontrolę ujemną. 2. Porównaj profile elektroforetyczne produktów PCR dla badanych szczepów E.coli. Oznacz genotypy i zapisz je w tabeli 4.

5 3. Wybierz najlepszy układ starterów. Przeprowadź dyskusję na temat skuteczności metody RAPD do różnicowania badanych szczepów. Wyniki genotypowania metodą RAPD Tabela 4 nr szczep Układ starterów Genotyp RAPD Piśmiennictwo: 1. Tyler K.D., Wang G., Tyler S.D., Johnson W.M Factors affecting reliability and reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial

6 pathogens. J. Clin. Microbiol. 35(2): Comment in: J. Clin. Microbiol (11): Caetano-Anolles G: Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers. PCR Methods Appl 1993, 3(2): Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV: DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 1990, 18(22): Caetano-Anolles G, Bassam BJ, Gresshoff PM: DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology (N Y) 1991, 9(6): Gzyl A, Augustynowicz E: Technical aspects of random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique in genotyping of bacterial strains. Acta Microbiol Pol 1999, 48(3):