Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY)

Transkrypt

1 Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY) Cel ćwiczenia Amplifikacja fragmentu genu amelogeniny, znajdującego się na chromosomach X i Y, jako celu molekularnego przydatnego w identyfikacji płci. Wstęp teoretyczny Amelogenina (AMGXY) jest głównym białkiem macierzy pozakomórkowej w zawiązku zęba. Ludzkie sekwencje kodujące amelogeninę obecne są na krótkim ramieniu chromosomu X (AMG; Xp) oraz blisko centromeru na chromosomie Y (ang. AMGL - amelogenin like sequence). Homologia sekwencji genu amelogeniny na obu chromosomach płci X i Y wynosi ok. 90%. Amplifikacja fragmentu genu amelogeniny przy użyciu jednej pary starterów pozwala na uzyskanie fragmentu o długości 505pz swoistego dla chromosomu Y i fragmentu o wielkości 158 pz swoistego dla chromosomu X. Stosując drugą parę starterów otrzymamy wielkości 977 pz i 788 pz. Interpretacja możliwych wyników przedstawiona jest w tabeli 9.1. Dzięki prostocie i czułości analizy reakcja została z powodzeniem wykorzystana do ustalania płci w badaniach śladów biologicznychi identyfikacji osobniczej. Genotyp AMGXY oznaczany za pomocą reakcji PCR Produkty PCR Produkty PCR układ 1 (startery AMY1 i AMY2) układ 2 (startery AMGF i AMGR) Płeć Tabela 1. XX 158 pz 977 pz kobieta XY 158 i 505pz 977 i 788 pz mężczyzna Piśmiennictwo 1. Herrot S., Ivorra J.L., Garcia-Sogo M., Martinez-Corina C., Biochemistry and Molecular Biology Techniques for Person Characterization, Biochemistry and Molecular Biology Education, 2008, vol. 36, No. 5, p Lattanzi W., Di Giacomo M.C., Lenato G.M., Chimienti G., Voglino G., Resta N., Pepe G., Guanti G., A large interstitial deletion encompassing the amelogenin gene on the short arm of the Y chromosome,hum Genet, 2005, 116: Nakahori Y, Takenaka O, Nakagome Y., A human X-Y homologous region encodes amelogenin", Genomics, 1991, 9 (2):

2 4. Thangaraj K, Reddy AG, Singh L., Is the amelogenin gene reliable for gender identification in forensic casework and prenatal diagnosis?, Int J Legal Med, 2002, 116 (2): Materiały: zestaw do izolacji DNA z wymazówek; postępować zgodnie z procedurą producenta kontrolne DNA kobiety (K1+), kontrolne DNA mężczyzny (K2+) 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mm roztwór MgCl 2, 8 mm mieszanina dntps startery: AMY1 (TTCTGATTTGGTACAGCTGGGG) i AMY2 (GCACTTTCTCTGGAGACCTTTCAAG) startery: AMGF (CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG) i AMGR (TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG) polimeraza DNA termostabilna Pwo Hypernova [2U/µl] (DNA Gdańsk) woda jałowa, agaroza, bufor 1xTEA, termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok, statywy do probówek Wykonanie 1. Przeprowadzić izolację DNA z własnych komórek pobranych w formie wymazów ze śluzówki policzka z wykorzystaniem zestawu do izolacji DNA zgodnie z instrukcją postępowania dostarczoną przez producenta. 2. Przygotować 4 probówki 0,2 ml i opisać je symbolami wg tabeli 9.2, uwzględniając kontrole dodatnie i ujemne. 3. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX zależnie od wybranego układu (tabele 2 i 3), zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA, wymieszać i rozporcjować po 24 µl.

3 Tabela 2 Skład mieszaniny reakcyjnej i profil temperaturowo czasowy reakcji PCR dla układu 1 Skłąd mieszaniny reakcyjnej Profil temperaturowo- czasowy Skład Ilość [µl] Temperatura x1 Master 1 K1+ K2+ K- [ C] MIX (x 5) Woda 14, x bufor Shark 2, MgCl 2 [20 mm] 2, dntps [8 mm] 2, AMY1 [10µM] 1, AMY2 [10µM] 1, Polimeraza Pwo [2U/µl] 0, DNA 1,0 X 1,0 1,0 1,0 - Objętość całkowita Czas [s] Liczba cykli Tabela 3 Skład mieszaniny reakcyjnej i profil temperaturowo czasowy reakcji PCR dla układu 2 Skłąd mieszaniny reakcyjnej Skład Ilość [µl] Temperatura x1 Master 1 K1+ K2+ K- [ C] MIX (x 5) Woda Profil temperaturowo- czasowy 10 x bufor Shark 2, MgCl 2 [20 mm] 2, dntps [8 mm] 2, AMGF [10µM] 1, AMGR [10µM] 1, Polimeraza Pwo [2U/µl] 0, DNA 1,0 X 1,0 1,0 1,0 - Objętość całkowita Czas [s] Liczba cykli

4 4. Do próbki oznaczonej nr 1 dodać 1 μl wyizolowanego DNA z wymazów, do próbki oznaczonej K1+ dodać 1 μl kontrolnego DNA kobiety, do próbki oznaczonej K2+ dodać 1 μl kontrolnego DNA mężczyzny, do kontroli ujemnej K- zamiast DNA dodać wodę. 5. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo czasowym, przedstawionym w tabeli 9.2 lub 9.3 (w zależności od wybranego układu). 6. Produkty PCR rozdzielać w żelu agarozowym 1,5% z dodatkiem bromku etydyny (0,5 mg/ml), w buforze 1xTAE przy napięciu ok. 7 V/cm długości żelu. Żel analizować w świetle UV. Wyniki i wnioski Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, próbę z własnego DNA, kontrole dodatnie oraz kontrolę ujemną. Zaznacz wielkości otrzymanych produktów PCR. W oparciu o wyniki amplifikacji określ płeć próbki badanej.

5