ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV

Transkrypt

1 ENZYMY RESTRYKCYJNE Enzymy z klasy endonukleaz (hydrolaz), wykazujące powinowactwo do specyficznych fragmentów dwuniciowych cząsteczek DNA i hydrolizujące wiązania fosfodiestrowe w obu niciach Naturalnie produkowane są przez bakterie (ich rolą jest wycinanie DNA bakteriofagów) Najczęściej miejscem tworzenia kompleksu enzymu z kwasem nukleinowym jest specyficzna (dla danego enzymu) sekwencja palindromowa, np.: 5 -TACGTA-3 3 -ATGCTA-5 Aktywność enzymu wyrażona jest w jednostkach (unitach); jednostka aktywności enzymu restrykcyjnego (U) to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1mg DNA faga λ (około 50kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37 C nazewnictwo: EcoRV ENZYMY RESTRYKCYJNE - pierwsza litera- rodzaj bakterii - druga i trzecia- gatunek - następna litera oznacza szczep lub typ - kolejne enzymy izolowane z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie Escherichia coli, szczep RY13; piąty enzym wyizolowany z tego szczepu CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? Budową, miejscem utworzenia kompleksu z DNA po rozpoznaniu sekwencji oraz mechanizmem enzymatycznym Rozpoznawaną sekwencją (jej długością i składem nukleotydowym) Miejscem hydrolizy w obrębie sekwencji 1

2 TYP I Enzymy zbudowane z trzech podjednostek strukturalnofunkcjonalnych Podjednostka S rozpoznaje Sekwencję DNA Podjednostka M Modyfikuje DNA Podjednostka R posiada aktywność Restrykcyjną Kompleks podjednostek R 2 M 2 S 1 jest enzymem restrykcyjnym (wymaga ATP i S-adenozylo-L-metioniny) gdy napotka niezmodyfikowany* DNA. *Podjednostki S i M tworzą metylazę, która rozpoznaje i modyfikuje DNA w obrębie określonej sekwencji Cięcie następuje w różnych niezdefiniowanych odległościach od miejsca rozpoznania, zwykle kilkaset do kilku tysięcy par zasad TYP II Enzymy, których aktywności metylazy i endonukleazy rozdzielone są między dwa odrębne białka kodowane przez różne geny nie wymagają obecności ATP ale MgCl 2 trawią DNA w obrębie sekwencji rozpoznania lub w niedużej, ściśle określonej odległości od niej, dając na ogół powtarzalne produkty trawienia rozpoznają krótkie najczęściej palindromiczne sekwencje 4-8pz wyróżnia się kilka klas w obrębie typu o homodimery, rozpoznają sekwencje asymetryczne, trawią w odległości 1-20pz od miejsca rozpoznania o homotetramery, rozpoznają sekwencje asymetryczne, trawią w miejscu rozpoznania TYP III Enzymy zbudowane z dwóch podjednostek strukturalnofunkcjonalnych Podjednostka M Modyfikuje DNA Podjednostka R posiada aktywność Restrykcyjną Kompleks podjednostek R 2 M 2 jest enzymem restrykcyjnym wymagającym do aktywności ATP i S-adenozylo-L-metioniny Cięcie następuje w odległości ok 20-30pz od miejsca rozpoznania, Rozpoznawane są sekwencje niesymetryczne o długości 5-6pz TYP IV Enzymy rozpoznające zmetylowany DNA 2

3 ROZPOZNAWANE SEKWENCJE Sekwencje czteronukleotydowe statystycznie, pojedynczy enzym rozpoznający sekwencję np. 5 -TATA-3 może trawić DNA co 256pz (4 4 ) Sekwencje sześcionukleotydowe statystycznie, pojedynczy enzym rozpoznający sekwencję np. 5 -GATTAG-3 może trawić DNA co ok 4096pz (4 6 ) Sekwencje ośmionukleotydowe wykazują znacznie mniej (co 4 8 pz)miejsc restrykcyjnych niż enzymy rozpoznające krótsze sekwencje Sekwencje niespecyficzne: 5 -GATSAG-3 5 -GATRAG-3 5 -GATNNNAG-3 wykazują znacznie więcej miejsc restrykcyjnych niż enzymy rozpoznające sekwencje specyficzne UNIWERSALNE NAZEWNICTWO NUKLEOTYDÓW IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) SYMBOL OPIS NUKLEOTYD A Adenina A C Cytozyna C G Guanina G T Tymina T U Uracyl U W Weak A T S Strong C G M amino A C K Keto G T R puryna A G Y pirymidyna C T B nie A (B występuje po A) C G T 1 2 D nie C (D występuje po C) A G T H nie G (H występuje po G) A C T 3 V niet (V występuje pot i U) A C G N No idea (ale nie miejsce puste = gap) A C G T 4 3

4 ROZPOZNAWANE SEKWENCJE Enzymy izolowane z różnych organizmów, ale rozpoznające te same sekwencje SphI -Streptomyces phaeochromogenes BbuI- Bacillus species, szczep Bu1709 PaeI- Pseudomonas aeruginosa MIEJSCE HYDROLIZY Enzymy hydrolizujące obie nici DNA w tym samym miejscupowstają tępe końce (blunt ends) HaeIII- Haemophilus aegyptius GG CC 5 -GGCC-3 5 -GG-3 5 -CC-3 3 -CC GG-5 3 -CC-5 3 -GG-5 Enzymy hydrolizujące każdą z nici DNA w innym miejscupowstają lepkie końce 3 (sticky ends) PstI- Providencia stuartii CTGCA G G ACGTC 5 -CTGCAG-3 5 -CTGCA-3 5 -G-3 3 -GACGTC-5 3 -G-5 3 -ACGTC-5 MIEJSCE HYDROLIZY Enzymy hydrolizujące każdą z nici DNA w innym miejscupowstają lepkie końce 5 (sticky ends) EcoRI- Escherichia coli szczep RY13 G AATTC CTTAA G 5 -GAATTC-3 5 -G-3 5 -AATTC-3 3 -CTTAAG-5 3 -CTTAA-5 3 -G-5 Neoschizomery- rozpoznają taką samą sekwencję DNA lecz przecinają ją w inny sposób SmaI- Serratia marcescens XmaI- Xanthomonas campestris CCC GGG GGG CCC C CCGGG GGGCC C 4

5 NIESPESYFICZNA AKTYWNOŚĆ Aktywność niespecyficzna (Star activity) pojawia się w przypadku, gdy warunki reakcji znacznie różnią się od optymalnych. Efektem jest zmiana (utrata) specyficzności enzymu Wysoka koncentracja glicerolu w mieszaninie reakcyjnej (>5% obj) Wysokie stężenie enzymu (pow. 100u) Niezoptymalizowany bufor (zasadowe ph; za wysoka zawartość jonów) Przedłużony czas reakcji enzymatycznej Obecność związków organicznych takich jak: DMSO, etanol, glikol etylenowy Zastąpienie (lub zwiększona koncentracja) jonów magnezu innymi dwudodatnimi jonami Mn 2+, Cu 2+, Co 2+ lub Zn 2+ EcoRI- rozpoznawalna sekwencja to 5 -GAATTC-3 zmienione trawione sekwencje to np. CAATTC, GAATTG, GTATTC STANDARDY/MARKERY WIELOŚCI MASY CZĄSTECZKOWEJ Plazmidy trawione jedną lub kilkoma restryktazami do uzyskania szeregu fragmentów o różnej (znanej) długości Wykorzystywane w elektroforezie DNA i RNA do wyznaczania długości migrujących cząsteczek Występują pod nazwami: standard masy; drabinka; marker masy cząsteczkowej STANDARDY/MARKERY WIELOŚCI MASY CZĄSTECZKOWEJ 5