Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

Transkrypt

1 Ćwiczenie 6 Technika PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując materiał genomowego DNA RtTA1 wyizolowany na drugich zajęciach. Wydajność i skuteczność amplifikacji sprawdza się elektroforetyczne (elektroforeza w 1% żelu agarozowym). Powielone fragmenty DNA zostaną poddane rekombinacji do wektora plazmidowego na kolejnych zajęciach. W celu ułatwienia rekombinacji startery do reakcji PCR wyposażono w sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej objętość końcowa 50 l składnik (stęż. wyjściowe) stęż. końcowe objętość ( l) uwagi!!! woda xxx najpierw woda DNA 500 ng xxx 10X stęż. bufor reakcyjny 1 X 5 25 mm MgCl2 2,5 mm 5 2 mm dntp M 3 5 M starter Fw 0,2-0,4 m 2 5 M starter Fw 0,2-0,4 m 2 Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość 50 l Profil termiczny reakcji temperatura ( C) czas (s) wstępna denaturacja denaturacja anealing starterów elongacja cykli W międzyczasie przygotować 1,5% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1x stężonym buforem TBE. Po zakończeniu reakcji amplifikacji mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, pobrać do nowej próbówki Epp 10 µl mieszaniny do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do studzienek w żelu. UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (marker typu drabinka). Prowadzić rozdział elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4 długości żelu. Po tym czasie żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle UV i poddać obraz analizie w celu ustalenia wydajności i specyficzności amplifikacji fragmentu DNA.

2 Ćwiczenie 7 Izolacja DNA z żeli agarozowych Wstęp Zestaw opiera sie na zdolności wiązania siπ DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Blok agarozy rozpuszczany jest w roztworze R7S, zawierającym sól chaotropową. Następnie, po dodaniu izopropanolu, mieszanina nanoszona jest na minikolumn ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie wiążąc się. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi buforami lub wodą i nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precytpitacji. Uwagi 1. Elektroforezę można przeprowadzić zarówno w buforze TAE, jak i TBE. 2. Zestaw umożliwia izolację fragmentów DNA w zakresie od 100 do 6000 par zasad. 3. Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 10 μg. Protokół izolacji DNA 1. Wyciąć kawałek agarozy wraz z zawartym w nim DNA. Uwaga: Całkowita masa wyciętego bloku nie powinna przekraczać 200 mg. 2. Przenieść do probówki eppendorfa i dodać 0.4 ml roztworu R7S. 3. Inkubować próbkę w 50 C, aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Mieszać od czasu do czasu przez odwracanie probówki. 4. Dodać 0.2 ml izopropanolu i wymieszać przez odwracanie probówki. 5. Krótko odwirować próbkę celem usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki. 6. Całość nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA i wirować 30 s przy obr./min. 7. Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki. Dodać do kolumny 0.6 ml roztworu płuczącego A1. 8. Wirować 30 s przy obr./min. 9. Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki. Dodać do kolumny 0.3 ml roztworu płuczącego A Wirować 2 min. przy obr./min. 11. Osuszoną kolumnę umieścić w nowej probówce eppendorfa i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać μl buforu TE (10mM TrisHCl, 1mM EDTA ph 8.0) lub jałowej wody destylowanej. Uwaga: W momencie dodawania roztworu elucyjnego (TE lub woda) należy zwrócić uwagę aby płyn całkowicie pokrył złoże. Powinno się go dodawać na środek kolumny, który dla lepszej widoczności ograniczony jest niebieskim pierścieniem. Jeżeli część płynu elucyjnego pozostanie na ściankach minikolumny, to elucja nie będzie wydajna. Elucja w 30 μl jest mniej wydajna ale uzyskane DNA ma wyższe stężenie. Elucja w 50 μl jest bardziej wydajna natomiast uzyskany preparat ma niższe stężenie. 12. Pozostawić na 3 min. w temperaturze pokojowej. 13. Wirować 1 min. przy obr./min. 14. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz.

3 Sprawdzanie wydajności izolacji fragmentu DNA z żelu przez elektroforezę Przygotowanie żelu agarozowego przygotować żelu agarozowy (o stężeniu odpowiednim dla wielkości uprzednio wyizolowanego z żelu fragmentu DNA) w buforze elektroforetycznym 1X stęż. TBE. Rozpuścić agarozę we wrzącej łaźni wodnej i gotować jeszcze przez co najmniej 10 min. ostudzić żel do temp. ok. 60ºC i wylać żel do rynienki tak aby ustawiony nad nią grzebień został zanurzony w żelu i spowodował powstanie studzienek po zastygnięciu żelu (minimum 30 min) wyjąć grzebień i napełnić aparat buforem 1X stęż. TBE do wysokości 5 mm nad powierzchnię żelu Przygotowanie próbek DNA Do sprawdzenia ilości wyizolowanego z żelu fragmentu DNA użyć 1/10 końcowej objętości, która używana była do elucji DNA z kolumny: np. jeśli elucja była w 30 µl należy sprawdzić 3 µl roztworu DNA. Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat przy nakładaniu do próbki dodajemy kilka l buforu TC lub wody. Do tak przygotowanej próbki dodajemy 6x stężonego buforu obciążającego (do końcowego stężenia 1X).

4 Ćwiczenia 9 Klonowanie genów w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA powielonego techniką PCR na poprzednich zajęciach do wektora plazmidowego. Etapy postępowania: Przygotowanie DNA wektora (puc19 trawiony równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi) Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR (trawienie równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi) przygotowanie reakcji ligacji DNA transformacja komórek kompetentnych E. coli DH5α) analiza zrekombinowanych klonów (izolacja plazmidowego DNA, analiza restrykcyjna i elektroforeza w 1% żelu agarozowym lub PCR kolonijny). 1) Przygotowanie plazmidu puc19 do klonowania trawienie wektora dwoma enzymami restrykcyjnymi Poddajemy trawieniu ok. 500 ng puc19 równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi w celu linearyzacji wektora oraz utworzenia lepkich końców. Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną: DNA puc19 Ok. 500 ng X l Bufor Enzymu I 1 X stężony 1 l Bufor Enzymu II 1 X stężony 1 l Enzym I 10 U 1 l Enzym II 10 U 1 l H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej objętości 20µl Przeprowadzamy trawienie w temp. 37 C przez min. 1 godz. Efektywność trawienia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu agarozowym 2) Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR i wyizolowanego z żelu (trawienie dwoma enzymami restrykcyjnymi) Poddajemy trawieniu dwoma enzymami restrykcyjnymi ok. 500 ng fragmentu DNA amplifikowanego PCR, oczyszczonego po amplifikacji, w celu uwolnienia lepkich końców. Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną: fragment PCR-DNA Ok. 500 ng X l Bufor Enzymu I 1 X stężony 1 l Bufor Enzymu II 1 X stężony 1 l Enzym I 10 U 1 l Enzym II 10 U 1 l H2O dejonizowana, jałowa do końcowej objętości 20µl Przeprowadzamy trawienie w temp. 37 C przez min. 1 godz. Efektywność cięcia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu agarozowym.

5 3) Łączenie cząsteczek DNA wektora z wyizolowanym z żelu DNA fragmentu PCR - reakcja ligacji Przy klonowaniu fragmentów DNA obowiązuje zasada molowego nadmiaru ilości klonowanego fragmentu w stosunku do wektora. Mieszanina reakcyjna powinna mieć jak najmniejszą objętość, co poprawia skuteczność ligacji. Do reakcji ligacji używamy: puc19/strawiony dwoma enzymami restrykcyjnymi: 125 ng DNA fragment PCR/strawionego dwoma enzymami restrykcyjnymi: - ok. 250 ng DNA 4 µl mieszaniny reakcyjnej 12 µl mieszaniny reakcyjnej bufor ligazy (końcowe stężenie 1X) 2 µl ligaza faga T4 (1U/ l) 2 µl UWAGA!!! Mieszaninę reakcyjną przygotowujemy w próbówkach Epp. 0,5 ml Tak przygotowana mieszanina jest właściwą reakcją ligacji. Oprócz niej przygotowuje się zwykle reakcję kontrolną, w której zamiast klonowanego fragmentu dodaje się dejonizowaną sterylną H 2 O. Reakcję ligacji przeprowadza się w temp. 12 C przez ok. 16 godz.

6 Ćwiczenie 10 Wprowadzanie cząsteczek DNA do komórek bakteryjnych transformacja. Celem ćwiczenia jest wprowadzenie zrekombinowanego DNA uzyskanego na poprzednich zajęciach do bakterii E. coli i wyselekcjonowanie na płytkach ze stałym podłożem transformantów, które pobrały zrekombinowane cząsteczki plazmidu. Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy. Proces transformacji został opisany u wielu rodzajów bakterii: najwyższą częstość uzyskuje się w obrębie tego samego gatunku (tak jest np. w przypadku bakterii z rodzaju Haemophilus), znacznie niższą między gatunkami. Wysoką aktywność transformującą wykazuje dsdna w formie liniowej. Wydajność transformacji zależy między innymi od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Zwiększenie stężenia DNA powyżej dawki nasycającej nie powoduje wzrostu liczby transformantów. U wielu bakterii (Haemophilus, Streptococcus, Bacillus) pobieranie DNA z otoczenia jest rezultatem ich naturalnego stanu kompetencji. Natomiast w przypadku szczepów Escherichia coli stan kompetencji bakterii uzyskuje się na drodze indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami wapnia). Metoda wykorzystująca 0,1 M roztwór chlorku wapnia jest powszechnie stosowanym sposobem otrzymania tzw. komórek kompetentnych. W tym stanie bakterii E. coli są zdolne do pobierania z otoczenia cząsteczek kolistego DNA np. plazmidu. Przygotowanie komórek kompetentnych: 1. Szczep Escherichia coli DH5α lub XL1-Blue odmłodzić przez dodanie 0,4 ml nocnej hodowli bakterii do 40 ml jałowej pożywki LB. 2. Bakterie hodować w temperaturze 37 C do uzyskania OD 600 = 0,4. 3. Następnie hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w łaźni lodowej na 5 min. Bakterie osadzić przez wirowanie w jałowej próbówce (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min). 4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml zimnego, jałowego roztworu 0,05 M CaCl 2. Całość inkubować w łaźni lodowej przez 30 minut. 5. Bakterie osadzić przez ponowne wirowanie (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min. ). 6. Osad bakteryjny zawiesić w 1 ml zimnego, jałowego roztworu CaCl 2 (0,05M). 7. Bakterie są gotowe do użycia. W celu zwiększenia wydajności transformacji inkubację w lodzie można przedłużyć do 12 godzin. Transformacja komórek bakteryjnych zrekombinowanym DNA 1. Do jałowej próbówki z 0,1 ml zawiesiny komórek kompetentnych dodać pipetą automatyczną całość mieszaniny ligacyjnej przygotowanej na poprzednich zajęciach. Równolegle wykonać próby kontrolne: 0,1 ml komórek kompetentnych kontrola komórek kontrola mutacji spontanicznych 0,1 ml komórek kompetentnych + kontrola ligacji (całość kontrolnej mieszaniny ligacyjnej tj. wektor trawiony enzymami, poddawany ligacji bez wstawki) 0,1 ml komórek kompetentnych + 2 µl plazmidu puc19 nietrawionego kontrola kompetencji 0,1 ml komórek kompetentnych + 5µl mieszaniny puc19/bam/hind kontrola wydajności trawienia wektora

7 2. Po delikatnym wymieszaniu próbówkę inkubować w łaźni lodowej przez minut. 3. Po tym czasie przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC i inkubować przez 2 minuty. 4. Dodać do próbówek 1 ml ogrzanej do 37ºC płynnej pożywki LB (bez antybiotyku). W celu uzyskania ekspresji genów wprowadzonych do komórki, bakterie inkubować przez minut wytrząsarce w temperaturze 37ºC. 5. Po tym czasie przenieść na płytki z podłożem LB zawierającym antybiotyk (podłoże selekcyjne). W tym celu hodowle krótko odwirować (1 min, 13 tys RPM), usunąć supernatant a osad zawiesić w l płynnej pożywki LB. Właściwą ligację wysiać na podłoże z antybiotykiem z dodatkiem X-gal i IPTG. Pozostałe kontrole wysiać na podłoża uzupełnione tylko antybiotykiem. Bakterie dokładnie rozprowadzić głaszczką na powierzchni podłoża agarowego. Płytki inkubować przez godzin w temperaturze 37ºC. 6. Po inkubacji w temperaturze 37ºC, policzyć kolonie, które wyrosły na wszystkich płytkach. Obliczyć wydajność transformacji. Analiza zrekombinowanych klonów. 1. Izolacja DNA plazmidowego i analiza restrykcyjna z użyciem enzymów flankujących polilinker wektora puc PCR z kolonii z zastosowaniem starterów komplementarnych do fragmentu DNA lub starterów uniwersalnych wektora (na kolejnych zajęciach).

8 Ćwiczenie 11 Analiza wyników klonowania - PCR kolonijny - część praktyczna Hybrydyzacja kwasów nukleinowych - część teoretyczna Celem ćwiczenia jest potwierdzenie obecności w transformantach E. coli uzyskanych na poprzednich zajęciach, zrekombinowanego plazmidu zawierającego sklonowany fragment DNA bakterii RtTA1. Jednym ze sposobów szybkiego przeszukiwania zrekombinowanych klonów jest tzw. PCR kolonijny, w którym jako źródło materiału genetycznego do amplifikacji wykorzystujemy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki selekcyjnej za pomocą sterylnej ezy lub końcówki pipety. Taki materiał biologiczny poddajemy działaniu wysokiej temp. bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej zawierającej wszystkie składniki niezbędne do powielania fragmentu DNA zrekombinowanego w wektorze plazmidowym. W trakcie inkubacji w temp. 96ºC bakterie ulegają lizie uwalniając materiał genetyczny, który stanowi matrycę do amplifikacji DNA w reakcji PCR. Wykonanie: Przygotować mieszaninę reakcyjną wg schematu podanego w tabeli. (Należy pamiętać, że przygotowanie mieszaniny reakcyjnej rozpoczynamy od dodania H 2 O, a enzym jest ostatnim składnikiem) 25 mm MgCl 2 10 µl 10 x stęż. bufor dla polimerazy Taq 10 µl 2 mm dntp 5 µl 5 µm starter Fw 4 µl 5 µm starter Rw 4 µl Polimeraza Taq 4 µl H 2 O 63 µl Mieszaninę rozpiptetować po 20 l do małych (0,2 ml) próbówek Eppendorfa i dodać sterylnie przy pomocy ezy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki. Przeprowadzić reakcję PCR wg pokazanego poniżej profilu termicznego reakcji Profil termiczny reakcji temperatura ( C) czas (s) wstępna denaturacja denaturacja przyłączanie starterów cykli elongacja * * w zależności od długości fragmentu DNA sklonowanego w wektorze plazmidowym Skuteczność amplifikacji sprawdzamy przez elektroforezę 15 µl mieszaniny reakcyjnej w 1,5% żelu agarozowym w obecności markera typu drabinki.