Ćwiczenie 1 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA

Transkrypt

1 Ćwiczenie 1 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA Plazmidy stanowią pozachromosomalny materiał genetyczny bakterii. Warunkują one szereg cech fenotypowych, jak oporność na leki, syntezę substancji o charakterze antybiotyków (bakteriocyn), toksyn i innych związków. Plazmidy występują w formie liniowych lub kolistych cząsteczek DNA i różnią się między sobą pod względem wielkości oraz liczby kopii w komórce gospodarza. W inżynierii genetycznej plazmidy wykorzystujemy często jako wektory do przenoszenia DNA pomiędzy komórkami tych samych lub różnych organizmów. Celem ćwiczenia jest izolacja z komórek Escherichia coli plazmidów, które różnią się wielkością oraz liczbą kopii, z użyciem dwóch różnych metod izolacji. Plazmidy: puc19 (Ap R ), puc98 (Ap R ), pcm351 (Gm R ), pbbr1mcs-2 (Km R ), pmp220 (Tc R ) DNA plazmidowy puc19 i puc98 będzie wykorzystywany na kolejnych zajęciach. I. Izolacja plazmidowego DNA wg metody lizy alkalicznej i oczyszczanie na złożu krzemionkowym MiniPrep Express Matrix 1. 5 ml hodowli E. coli zawierającej odpowiedni plazmid inkubować z wytrząsaniem przez noc w temp. 37ºC w płynnym podłożu LB uzupełnionym odpowiednim antybiotykiem. 2. W probówce Eppednorfa zwirować 2 ml nocnej hodowli bakteryjnej (1 min, g) (UWAGA! Przed pobraniem hodowle bakteryjne należy zworteksować!). 3. Usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej. 4. Osad bakteryjny bardzo dokładnie zawiesić w 200 μl roztworu TEG, nie pozostawiając zbitych grudek osadu bakterii na dnie eppendorfa. 5. Na świeżo przed użyciem przygotować w 2 ml eppendorfie 1,5 ml alkalicznego roztworu lizującego z roztworów wyjściowych 2 M NaOH i 10% (w/o) SDS. 6. Dodać do zawiesiny bakterii 400 μl alkalicznego roztworu lizującego i ostrożnie wymieszać zawartość probówki do całkowitej lizy (zwykle wystarczy 6-krotne odwrócenie probówki). 7. Dodać 300 μl roztworu zobojętniającego i ostrożnie wymieszać przez 5-krotne odwrócenie probówki (powinien pojawić się biały precypitat). 8. Lizat wirować przez 7 min przy g. 9. Supernatant ostrożnie przenieść do nowej próbówki, uważając aby nie pobrać białego osadu. 10. Dodać 400 μl zawiesiny złoża krzemionkowego i wymieszać przez 5-krotne odwrócenie probówki (UWAGA! Zawiesinę bardzo dokładnie wymieszać przed każdym użyciem!). 11. Krzemionkę ze związanym DNA wirować (30 s przy g), supernatant usunąć. 12. Dodać do osadu 600 μl 70% etanolu i wytrząsać do uzyskania jednorodnej zawiesiny. 13. Wirować przez 30 s przy g, a następnie bardzo dokładnie usunąć etanol. 14. Złoże krzemionkowe suszyć przez 5 min w wirówce próżniowej. 15. Do osuszonej krzemionki dodać 50 μl wody jałowej wolnej od nukleaz i ostrożnie wymieszać (UWAGA! Nie pipetować!) końcówką tipa (UWAGA! Dokładne zawieszenie złoża zapewnia maksymalną wydajność elucji plazmidowego DNA!). 16. Próbki pozostawić na 3 min w temp. pokojowej, a następnie zwirować (2 min, g). 17. Do nowej probówki przenieść 40 μl supernatantu zawierającego plazmidowy DNA, uważając aby nie pobrać osadu krzemionki. Próbki plazmidowego DNA przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz.

2 II. Izolacja plazmidowego DNA wg metody lizy termicznej 1. 5 ml hodowli E. coli zawierającej odpowiedni plazmid inkubować z wytrząsaniem przez noc w temp. 37ºC w płynnym podłożu LB uzupełnionym odpowiednim antybiotykiem. 2. W probówce Eppednorfa zwirować 2 ml nocnej hodowli bakteryjnej (1 min, g) (UWAGA! Przed pobraniem hodowle bakteryjne należy zworteksować!). 3. Usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej. 4. Osad bakteryjny bardzo dokładnie zawiesić w 350 μl roztworu STET, nie pozostawiając zbitych grudek osadu bakterii na dnie eppendorfa (UWAGA! Roztwór STET bardzo się pieni należy pipetować go delikatnie!). 5. Dodać 25 μl roztworu lizozymu, worteksować przez 5 s i inkubować mieszaninę przez 1 min w temp. pokojowej. 6. Próbkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 1 min i natychmiast odwirować przez 7 min przy g. 7. Supernatant ostrożnie przenieść do nowej próbówki, aby nie pobrać osadu z dna eppendorfa (UWAGA! Przenosząc supernatant należy zmierzyć jego objętość!). 8. Do supernatantu dodać 0,6 objętości izopropanolu i delikatnie wymieszać przez 5-krotne odwrócenie eppendorfa. 9. Wirować przez 15 min przy g. 10. Ostrożnie odsączyć supernatant przy pomocą pompki wodnej. 11. Dodać do osadu 500 μl 70% etanolu i delikatnie wymieszać przez 3-krotne odwrócenie. 12. Wirować przez 5 min przy g, a następnie ostrożnie odsączyć etanol. 13. Do osuszonego osadu dodać 50 μl wody jałowej wolnej od nukleaz i pozostawić na 3 min w temp. pokojowej. Próbki plazmidowego DNA przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz. Materiały: roztwór TEG glukoza Tris-HCl (ph 8) EDTA 50 mm 25 mm 10 mm alkaliczny roztwór lizujący NaOH 0,2 M SDS 1% roztwór zobojętniający octan potasu 3 M kwas octowy lodowaty 11,5% (o/o) roztwór STET sacharoza Tris-HCl (ph 8) EDTA Triton X-100 8% (w/o) 50 mm 50 mm 5% (o/o) roztwór lizozymu 10 mg/ml w 10 mm roztworze Tris-HCl (ph 8)

3 Ćwiczenie 2 Izolacja genomowego DNA z bakterii i elektroforeza agarozowa DNA Celem ćwiczenia jest izolacja genomowego (całkowitego) DNA z bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Następnie należy przeprowadzić rozdział elektroforetyczny i porównać otrzymany obraz elektroforetycznego dla próbek genomowego i plazmidowego DNA (wyizolowanego na poprzednich zajęciach). W przypadku elektroforezy plazmidowego DNA należy zaobserwować zależność drogi migracji od wielkości cząsteczki plazmidu, obecność form konformacyjnych oraz porównać ilość i jakość uzyskanego DNA, zależnie od zastosowanej metody izolacji plazmidów. I. Izolacja genomowego DNA z bakterii za pomocą zestawu Genomic Mini Zasada działania zestawu opiera się na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w buforach o wysokiej sile jonowej. Komórki bakterii poddawane są lizie w uniwersalnym roztworze lizującym (LT), zawierającym sole i detergenty niejonowe. Dodatkowo w procesie lizy uczestniczy silna proteaza (proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komórek i degradacji wszystkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, zaś zanieczyszczenia zostają wypłukane z kolumny roztworem A1. Oczyszczone DNA wymywane jest z kolumny niskojonowymi buforami lub wodą ml hodowli Rhizobium inkubować z wytrząsaniem przez 48 godz. w temp. 28ºC w płynnym podłożu 79CA. 2. Ustawić termobloki na 37ºC i 70ºC. 3. Do eppendorfa o poj. 2 ml przenieść 150 μl wody jałowej i umieścić w termobloku o temp. 70ºC podgrzana woda będzie wykorzystywana do elucji w punkcie 17. protokołu. 4. W probówce zwirować 2 ml hodowli bakteryjnej (5 min, g) (UWAGA! Przed pobraniem hodowle bakteryjne należy zworteksować!). 5. Usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej. 6. Osad bakteryjny bardzo dokładnie zawiesić w 100 μl buforu Tris, nie pozostawiając zbitych grudek osadu bakterii na dnie eppendorfa. 7. Dodać 200 µl roztworu lizującego LT oraz 20 µl Proteinazy K. 8. Całość wymieszać przez odwracanie probówki i inkubować 20 min w temp. 37ºC. 9. Przenieść próbki do 70ºC i inkubować przez 5 min. 10. Lizaty intensywnie worteksować przez 20 s, a następnie wirować 5 min przy g. 11. Supernatant ostrożnie nanieść na minikolumnę umieszczoną w probówce odbierającej i wirować 1 min przy g. 12. Z probówki odbierającej wylać supernatant i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 13. Dodać do minikolumny 500 µl roztworu płuczącego A1 i wirować 1 min przy g. 14. Z probówki odbierającej wylać supernatant i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 15. Dodać do minikolumny 400 µl roztworu płuczącego A1 i wirować 2 min przy g. 16. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej i wirować 1 min przy g. 17. Osuszoną minikolumnę przenieść do nowej probówki o poj. 1,5 ml. Na złoże krzemionkowe na dnie minikolumny nanieść 100 µl wody, uprzednio ogrzanej do temp. 70ºC. 18. Inkubować próbkę przez 5 min w temp. pokojowej, a następnie zwirować przez 1 min przy g. 19. Usunąć minikolumnę, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówkach przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz.

4 II. Elektroforeza agarozowa DNA Elektroforeza w żelach agarozowych jest techniką używaną do rozdziału, oznaczania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Rozdział polega na migracji rozdzielanych substancji pod wpływem przyłożonego prądu elektrycznego. W obojętnym ph DNA ma ładunek ujemny i wędruje do anody. Przygotowanie żelu agarozowego: 1. Przygotować 100 ml 0,7% żelu agarozowego w 1 stężonym buforze elektroforetycznym TBE (uprzednio rozcieńczonym z roztworu 10 stężonego). 2. Agarozę rozpuścić poprzez kilkuminutowe gotowanie na grzałce elektrycznej lub w kuchence mikrofalowej. 3. Ostudzić agarozę do temp. ok. 60ºC pod bieżącą wodą lub pozostawiając ją w temp. pokojowej. 4. Wylać żel do rynienki, tak aby ustawiony nad nią grzebień został zanurzony w żelu i spowodował powstanie studzienek. 5. Po zastygnięciu żelu (ok. 30 min. w temp. pokojowej) wyjąć grzebień i umieścić żel w aparacie do elektroforezy. 6. Aparat napełnić 1 stężonym buforem TBE do wysokości 5 mm nad powierzchnię żelu. Przygotowanie próbek do elektroforezy: Do sprawdzenia ilości wyizolowanego DNA używany jest zwykle niewielka objętość uzyskanego w trakcie izolacji roztworu DNA. Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat przy nakładaniu próbki do żelu dodajemy kilka μl wody. Do tak przygotowanej próbki dodajemy 6 stężonego buforu próbkowego (do końcowego stężenia 1 ). Bufor próbkowy służy do zagęszczenia próbki DNA, tak by umożliwić jej nałożenie do studzienki w żelu, oraz do obserwacji postępu elektroforezy. Barwniki migrują w żelu razem z cząsteczkami DNA. W 1% żelu agarozowym szybkość migracji błękitu bromofenolowego odpowiada szybkości migracji liniowej cząsteczki dsdna (dwuniciowe DNA) o wielkości ~300 pz, podczas gdy cyjanian ksylenu migruje z szybkością równą fragmentom dsdna o wielkości ~4000 pz. 1. Próbki DNA do elektroforezy przygotowujemy w nowych probówkach o poj. 1,5 ml. Pozostałą część przechowujemy w temp. 20 C do czasu dalszych analiz. 2. Całość przygotowanej próbki nakładamy do studzienki w żelu i włączamy zasilanie ze stabilizatora prądu (dla uzyskanie optymalnego rozdziału napięcie powinno wynosić 5 V/cm odległości pomiędzy elektrodami aparatu do elektroforezy, a w naszym przypadku 130 V). 3. Prowadzić elektroforezę do momentu kiedy błękit bromofenolowy osiągnie ⅔ długości żelu. 4. Wyłączyć zasilanie, wyjąć żel z aparatu, umieścić w wanience zawierającej 0,05% wodny roztwór bromku etydyny i barwić żel 10 min. 5. Podświetlić żel lampą UV i obserwować powstałe prążki DNA. Materiały: bufor 1 TBE Tris Kwas borowy EDTA 89 mm 89 mm 2 mm bufor próbkowy 6 DNA Loading Dye Tris-HCl (ph 7,6) 10 mm błękit bromofenolowy 0,03% cyjanian ksylenu FF 0,03% glicerol 60% EDTA 60 mm

5 Ćwiczenie 3 Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do konstrukcji mapy fizycznej DNA Celem ćwiczenia jest konstrukcja mapy fizycznej wstawki plazmidu puc98 przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI, HindIII i PstI. W trakcie ćwiczenia studenci przygotowują reakcje trawienia DNA pojedynczymi enzymami restrykcyjnymi oraz trawienia kombinacjami dwóch enzymów restrykcyjnych: 1. EcoRI + HindIII, 2. EcoRI + PstI oraz 3. HindIII + PstI. Następnie oznaczają wielkości fragmentów restrykcyjnych w oparciu o ruchliwość elektroforetyczną w żelu agarozowym i porównanie drogi migracji fragmentów DNA z markerem wielkości. Na tej podstawie konstruowana jest mapa restrykcyjna wstawki plazmidu puc98. Przygotowanie reakcji trawienia plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi (UWAGA! Enzymy restrykcyjne należy trzymać w lodzie!): 1. Całkowicie rozmrozić i wymieszać bufory reakcyjne oraz plazmidowy DNA, który będzie poddawany trawieniu. Wszystkie składniki do nastawienia reakcji trawienia (w tym enzymy restrykcyjne) krótko zwirować i wstawić do lodu. 2. W eppendorfie o poj. 1,5 ml połączyć składniki mieszaniny reakcyjnej we wskazanej kolejności: A) Trawienia pojedynczymi enzymami restrykcyjnymi: Składnik Ilość woda jałowa (wolna od nukleaz) uzupełnić do 20 μl odpowiedni bufor (10 stężony) 2 μl plazmidowy DNA 0,5 1 µg enzym restrykcyjny (10 U/μl) 1 μl B) Trawienia kombinacjami dwóch enzymów restrykcyjnych: Składnik Ilość woda jałowa (wolna od nukleaz) uzupełnić do 20 μl odpowiedni bufor (10 stężony) 2 μl plazmidowy DNA 0,5 1 µg enzym restrykcyjny I (10 U/μl) 1 μl enzym restrykcyjny II (10 U/μl) 1 μl 3. Przygotowaną mieszaninę reakcyjną delikatnie wymieszać i krótko zwirować. 4. Probówki umieścić w termobloku i inkubować w 37ºC przez 1 h. 5. W międzyczasie przygotować 0,7% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1 stężonym buforem TBE. 6. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, do każdej dodać po 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do studzienek w żelu (UWAGA! Do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA!). 7. Prowadzić elektroforezę do momentu kiedy błękit bromofenolowy osiągnie ⅔ długości żelu. 8. Wyłączyć zasilanie, wyjąć żel z aparatu, umieścić w wanience zawierającej 0,05% wodny roztwór bromku etydyny i barwić żel 10 min. 9. Podświetlić żel lampą UV i poddać obraz analizie w celu ustalenia wielkości fragmentów restrykcyjnych. 10. Skonstruować mapę restrykcyjną plazmidu puc98.

6 Ćwiczenie 4 Zastosowanie enzymów restrykcyjnych zadania 1. Przyjmujemy, że ludzki genom ma 3 miliardy par zasad, a 60% par zasad w ludzkim DNA stanowi A T. Odpowiedz na pytania dotyczące wymienionych poniżej enzymów restrykcyjnych: (i) Ile razy w genomie wystąpią w przybliżeniu miejsca restrykcyjne dla poniższych enzymów? (ii) Ile fragmentów restrykcyjnych powstanie w wyniku trawienia ludzkiego genomu danym enzymem? (iii) Jaki będzie średni rozmiar fragmentów ludzkiego genomu po strawieniu enzymem? (iv) Jaki rodzaj końców uzyskamy przy cięciu danym enzymem (lepkie, tępe), a w przypadku końców lepkich z jakiego rodzaju nadmiernością (5ʹ czy 3ʹ)? (v) Jeśli enzym wytwarza lepkie końce, to czy nadmierności uzyskane na wszystkich fragmentach ludzkiego genomu przy trawieniu tym enzymem będą identyczne? a. SmaI (5ʹ CCC^GGG 3ʹ) b. Sau3AI (5ʹ ^GATC 3ʹ) c. BslI (5ʹ CCNNNNN^NNGG 3) (N oznacza dowolny z czterech nukleotydów, a symbol ^ oznacza miejsce cięcia). 2. Cząsteczkę kolistego plazmidowego DNA strawiono całkowicie w oddzielnych reakcjach enzymami HindIII, EcoRI oraz mieszaniną dwóch enzymów. Po rozdziale elektroforetycznym uzyskano wzorce trawienia widoczne na zdjęciu. Na podstawie porównania drogi migracji uzyskanych w trawieniach fragmentów DNA z drogą migracji wzorca wielkości, zidentyfikowane liniowe fragmenty DNA następującej długości: HindIII 50 EcoRI HindIII / EcoRI Skonstruuj mapę restrykcyjną tego plazmidu. 3. W wyniku trawienia kolistej cząsteczki DNA otrzymano następujące fragmenty: BamHI 5,2 HindIII 2,6 1,2 0,8 0,6 BamHI / HindIII 1,4 1,2 0,8 0,6 Narysuj mapę restrykcyjną tej cząsteczki. 4. W wyniku trawienia kolistej cząsteczki DNA otrzymano następujące fragmenty: EcoRI 6 4 BamHI 9 1 BamHI / EcoRI Narysuj mapę restrykcyjną tej cząsteczki.

7 5. Liniowy fragment DNA poddano działaniu dwóch enzymów restrykcyjnych uzyskując następujące fragmenty po trawieniu: HindIII EcoRI HindIII / EcoRI Narysuj mapę restrykcyjną tej cząsteczki. Rozmiary fragmentów po podwójnym trawieniu pozwalają skonstruować dwie alternatywne mapy. Jak przetestować, która z map restrykcyjnych jest prawdziwa? 6. Liniowy fragment DNA poddano działaniu dwóch enzymów restrykcyjnych uzyskując następujące fragmenty po trawieniu: HindIII EcoRI HindIII / EcoRI Narysuj mapę restrykcyjną tej cząsteczki. 7. Kolisty plazmid trawiono restryktazami. Następujące fragmenty zostały zidentyfikowane w żelu agarozowym po cięciu poszczególnymi enzymami: EcoRI 7 SalI 7 HindIII SalI / HindIII 2,5 2 1,5 1 EcoRI / HindIII 4 2 0,6 0,4 EcoRI / SalI 2,9 4,1 Narysuj mapę restrykcyjną plazmidu dla tych trzech enzymów. 8. Wektor plazmidowy pbs281 został pocięty enzymem BamHI (5ʹ G^GATCC 3ʹ), który rozpoznaje tylko jedno miejsce w tej cząsteczce. Genomowy DNA człowieka został natomiast pocięty enzymem MboI (5ʹ ^GATC 3ʹ), dla którego w DNA człowieka występuje wiele miejsc restrykcyjnych. Pocięte cząsteczki zostały ze sobą zligowane. Rozpatrujemy tylko te cząsteczki, które powstały z ligacji plazmidu i fragmentu genomowego DNA. Odpowiedz na poniższe pytania: a. Jaka część cząsteczek może zostać przecięta enzymem MboI? b. Jaka część powstałych cząsteczek może zostać przecięta enzymem BamHI? c. Jaka część cząsteczek może zostać przecięta enzymem XorII (5ʹ C^GATCG 3ʹ)? 9. Cząsteczka DNA, której sekwencja jest podana poniżej, została całkowicie strawiona za pomocą enzymu EcoRI (5ʹ G^AATTC 3ʹ). Ile cząsteczek DNA powstanie w wyniku tej reakcji? Wypisz sekwencje uzyskanych w trawieniu fragmentów DNA z zaznaczeniem ich biegunowości. Czy wszystkie z uzyskanych fragmentów mogą zostać sklonowane do wektora plazmidowego w miejsce EcoRI? Co w tym przypadku wydaje się niezwykłe (choć nie niemożliwe) w odniesieniu do cząsteczki DNA o losowej sekwencji nukleotydowej? 5 A G A T G A A T T C G C T G A A G A A C C A A G A A T T C G A T T 3 3 T C T A C T T A A G C G A C T T C T T G G T T C T T A A G C T A A 5

8 10. DNA genomowy bakteriofaga λ ma w postaci liniowej na każdym z końców jednoniciowe nadmierności długości 20 pz. Są to lepkie końce, które w tym przypadku nie są wynikiem trawienia enzymem restrykcyjnym, ale można je połączyć przy użyciu ligazy, z utworzeniem kolistej cząsteczki DNA. W serii oddzielnych reakcji liniowe lub koliste DNA strawiono całkowicie enzymami EcoRI, BamHI lub mieszaną obydwu enzymów i rozdzielono elektroforetycznie: a. Która z próbek (A czy B) reprezentuje trawienie kolistej postaci faga λ? Uzasadnij. b. Jaka jest całkowita długość formy liniowej i formy kolistej DNA faga λ? c. Narysuj mapy restrykcyjne dla formy liniowej i kolistej genomu faga λ z zaznaczeniem miejsc restrykcyjnych EcoRI i BamHI. d. Dlaczego powyższe reakcje trawienia rozdzielano w elektroforezie agarozowej a nie poliakrylamidowej? 11. Polimorfizm to zmiana sekwencji nukleotydów występująca w populacji częściej niż u 1% osobników. Istnieje kilka rodzajów polimorfizmów, m.in. pojedynczych nukleotydów SNP (ang. single nucleotide polymorphism). Polimorfizmy DNA typu SNP można wykrywać za pomocą trawienia DNA endonukleazami (PCR-RFLP): substytucja pojedynczego nukleotydu zmienia miejsce rozpoznania dla konkretnego enzymu. Polimorficzne allele mogą powodować zmiany funkcji genu i być powodem zwiększonego ryzyka rozwoju danej choroby. Dla genu kodującego ludzki receptor witaminy D3 znanych jest ponad 60 różnych polimorfizmów, które najczęściej są badane w chorobach związanych z metabolizmem kości. Rozpatrujemy dwa polimorfizmy VDR: Lp. Nazwa SNP Lokalizacja i charakter zmiany 1. FokI Tranzycja T>C w pierwszym kodonie produkt białkowy krótszy o 3 aminokwasy 2. BsmI Tranzycja G>A w intronie 8. brak wpływu na sekwencję produktu białkowego; wpływ na poziom transkrypcji genu VDR, stabilność mrna oraz jego potranskrypcyjne modyfikacje Enzym FokI rozpoznaje miejsce 5ʹ GGATGN9 3ʹ, natomiast enzym BsmI 5ʹ NGCATTC 3ʹ (zaznaczono miejsca polimorficzne). Zaprojektowano startery do reakcji PCR, które pozwalają amplifikować odcinki DNA obejmujące badane miejsca polimorficzne: Lp. Nazwa SNP Wielkość PCR Długość produktów trawienia 1. FokI 499 pz 439 pz, 60 pz 2. BsmI 401 pz 298 pz, 103 pz Jakiej długości produkty trawienia zaobserwujemy po rozdziale elektroforetycznym dla wszystkich możliwych genotypów w przypadku badanych SNP?

9 Ćwiczenie 5 Amplifikacja fragmentów DNA w reakcji PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując jako źródło matrycy genomowy DNA RtTA1 wyizolowany na poprzednich ćwiczeniach. Wydajność i specyficzność amplifikacji sprawdza się elektroforetycznie. Powielone fragmenty DNA zostaną poddane rekombinacji do wektora plazmidowego puc19 na kolejnych zajęciach. W celu ułatwienia rekombinacji startery do reakcji PCR wyposażono w sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne EcoRI (starter forward) oraz HindIII (starter reverse). Przygotowanie reakcji PCR (UWAGA! Składniki mieszaniny reakcyjnej trzymamy w lodzie!): 1. Całkowicie rozmrozić i wymieszać wszystkie komponenty niezbędne do nastawienia reakcji PCR. Składniki krótko zwirować i wstawić do lodu. 2. W eppendorfie o poj. 1,5 ml przygotować 20-krotne rozcieńczenie wyizolowanego całkowitego DNA RtTA1, zworteksować, krótko zwirować i wstawić do lodu. 3. W eppendorfie o poj. 0,2 ml połączyć składniki mieszaniny reakcyjnej: Składnik Stężenie wyjściowe Stężenie końcowe Przykładowa objętość woda jałowa uzupełnić do 50 μl 30 μl bufor reakcyjny 10 stężony 1 stężony 5 μl mieszanina dntp 2 mm każdego z dntp 0,2 mm każdego z dntp 5 μl starter forward 10 μm 0,1 1 μm 2 μl starter reverse 10 μm 0,1 1 μm 2 μl MgCl2 25 mm 1 4 mm 3 μl matryca DNA 10 pg 1 μg 2 μl polimeraza DNA Taq 1 U/μl 0,5 2 U 1 μl 4. Przygotowaną mieszaninę reakcyjną delikatnie wymieszać i krótko zwirować. 5. Probówkę umieścić w termocyklerze i uruchomić program o następującym profilu reakcji: Etap Temperatura Czas Liczba cykli wstępna denaturacja DNA 96 C 5 min 1 denaturacja DNA 94 C 30 s hybrydyzacja starterów 55 C 30 s 35 synteza DNA 72 C 36 s końcowa elongacja DNA 72 C 7 min 1 6. Przygotować 0,7% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1 stężonym TBE. 7. Po zakończeniu reakcji PCR mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, pobrać do nowej probówki 5 μl mieszaniny, dodać 5 µl wody i 2 µl buforu próbkowego, wymieszać, krótko zwirować i w całości nanieść do studzienki w żelu (UWAGA! Do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA!). Prowadzić elektroforezę do momentu kiedy błękit bromofenolowy osiągnie ⅔ długości żelu. Następnie żel barwić przez 10 min w 0,05% wodnym roztworze bromku etydyny i poddać analizie w celu ustalenia wydajności i specyficzności amplifikacji fragmentu DNA. 8. Otrzymane produkty PCR przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz.

10 Ćwiczenie 6 Izolacja DNA z żelu agarozowego Celem ćwiczenia jest izolacja z żelu agarozowego produktów reakcji PCR uzyskanych na poprzednich zajęciach. DNA zostanie wyizolowany i oczyszczony za pomocą zestawu Gel-Out. Zestaw przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji fragmentów DNA bezpośrednio z żeli agarozowych. Podczas procesu ekstrakcji usunięte zostają agaroza, bromek etydyny oraz inne zanieczyszczenia obecne w próbce. Zasada działania zestawu opiera się na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Bloczek agarozy rozpuszczany jest w roztworze R7S, który ułatwia rozpuszczanie agarozy, powoduje denaturację białek oraz zawiera sól chaotropową. Następnie, po dodaniu izopropanolu, mieszanina nanoszona jest na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie wiążąc się. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi buforami lub wodą i nadaje się do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej bez konieczności precytpitacji. 1. Do produktów PCR dodać bufor obciążający i w całości nanieść do studzienek w żelu (UWAGA! Do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA!). 2. Prowadzić elektroforezę w 0,7% żelu agarozowym w buforze 1 TBE, do momentu wystarczającego rozdzielenia fragmentów DNA. Należy używać świeżo przygotowanego buforu, zarówno do przeprowadzenia elektroforezy, jak i przygotowania żelu. 3. W międzyczasie przygotować drugi 0,7% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1 stężonym TBE. 4. Po zakończonej elektroforezie żel barwić przez kilka minut w 0,05% wodnym roztworze bromku etydyny. 5. Nastawić termoblok na 50ºC, a następnie zważyć probówkę o poj. 1,5 ml. 6. Przy pomocy czystego skalpela wyciąć prążek DNA w taki sposób, aby pozbyć się nadmiaru agarozy (całkowita masa wyciętego bloczka agarozy nie powinna przekraczać 200 mg). Operację wycinania prążka DNA należy wykonać możliwie szybko, aby zminimalizować oddziaływanie promieniowania UV na izolowane DNA. Jest to szczególnie istotne, gdy wyizolowane DNA będzie bezpośrednio wykorzystywane w reakcjach sekwencjonowania lub klonowania molekularnego. 7. Przenieść wycięty bloczek agarozowy do probówki eppendorfa, a następnie zważyć. Jeśli masa bloczka agarozowego przekracza 200 mg należy podzielić bloczek na mniejsze fragmenty i przenieść do kolejnych probówek 1,5 ml. 8. Dodać 400 µl roztworu R7S i inkubować mieszaninę w temp. 50 C do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy. Podczas inkubacji kilka razy mieszać próbkę poprzez kilkukrotne odwracanie probówki (UWAGA! Przed przystąpieniem do dalszych czynności należy upewnić się, że agaroza została całkowicie rozpuszczona). 9. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka probówki, a następnie dodać 200 µl izopropanolu i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki. 10. Krótko odwirować próbkę celem usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki. 11. Całość nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA umieszczoną w probówce odbierającej i wirować 30 s min przy g. 12. Z probówki odbierającej wylać supernatant i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 13. Dodać do minikolumny 600 µl roztworu płuczącego A1 i wirować 30 s przy g.

11 14. Z probówki odbierającej wylać supernatant i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 15. Dodać do minikolumny 300 µl roztworu płuczącego A1 i wirować 2 min przy g. 16. Przenieść minikolumnę do pustej probówki o poj. 1,5 ml i wirować 1 min przy g. Etap wirowania na sucho ma na celu całkowite usunięcie resztek etanolu, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych. 17. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce eppendorfa o poj. 1,5 ml i do złoża znajdującego się na dnie minikolumny dodać 30 µl jałowej wody destylowanej (UWAGA! Istotne w tym przypadku jest dodanie wody centralnie na powierzchnię złoża. Jeżeli część płynu elucyjnego pozostanie na ściankach minikolumny, to elucja będzie mało wydajna). 18. Inkubować próbkę przez 5 min w temp. pokojowej, a następnie zwirować przez 1 min przy g. 19. Pobrać do nowej probówki 3 μl wyizolowanego produktu PCR, dodać 7 µl wody i 2 µl buforu próbkowego, wymieszać, krótko zwirować i w całości nanieść do studzienki w żelu (UWAGA! Do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA!). 20. Prowadzić elektroforezę do momentu kiedy błękit bromofenolowy osiągnie ⅔ długości żelu. Następnie żel barwić przez 10 min w 0,05% wodnym roztworze bromku etydyny i poddać analizie w celu ustalenia wydajności izolacji DNA z żelu agarozowego. 21. Uzyskane izolaty DNA przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz.