DNA YEAST KIT Nr kat. EM10 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji totalnego DNA z drożdży EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
DNA YEAST KIT I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA YEAST przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji drożdżowego DNA o wysokiej czystości z hodowli płynnych i powierzchniowych oraz osadów mrożonych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU 50 150 Liczba izolacji izolacji izolacji 250 izolacji 3 izolacje (DEMO) Nr katalogowy EM10-050 EM10-150 EM10-250 EM10-D YS Buffer 10 ml 30 ml 50 ml 600 µl YL Buffer 15 ml 45 ml 75 ml 900 µl Proteinase K (lyophilized) 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. Proteinase Buffer 700 µl 2,1 ml 3,5 ml 200 µl Lysis Mix 100 µl 300 µl 500 µl 6 µl RNase A (lyophilized) 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. RNase Buffer 220 µl 660 µl 1,1 ml 100 µl YB Buffer 18 ml 53 ml 88 ml 1,1 ml YW Buffer 50 ml 150 ml 250 ml 3 ml Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 600 µl DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Enzymy RNaza A oraz proteinaza K dostarczane są w postaci liofilizowanej. Każda probówka zawiera odpowiednią ilość enzymu do przeprowadzenia 50 izolacji DNA. Liofilizaty enzymów należy przechowywać w temp. +4 C. Przed pierwszym użyciem liofilizat RNazy A należy rozpuścić w 220 µl RNase Buffer (w zestawie DEMO w 100 µl RNase Buffer). RNaza A w roztworze przechowywana w temp. +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeśli wymagane jest przechowywanie RNazy A przez dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNazy i przechowywanie w temp. -20 C. www.dnagdansk.com
Nr kat. EM10 Liofilizat proteinazy K należy rozpuścić w 700 µl Proteinase Buffer (w zestawie DEMO w 200 µl Proteinase Buffer). Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. -20 C! Roztwór Lysis Mix należy przechowywać w temp. -20 C. Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT jałowe próbówki wirownicze typu Eendorf (1,5-2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5-2 ml (> 10 tys. rpm) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) worteks IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA składa się z 5 etapów i przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże, wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie dezintegracji ulega ściana komórkowa drożdży. Powstałe w ten sposób sferoplasty poddawane są następnie lizie enzymatycznej z wykorzystaniem YL Buffer oraz proteinazy K. W tym etapie następuje degradacja błon i białek komórkowych. Dodatkowo w celu otrzymania DNA wolnego od RNA stosuje się RNazę A. Po dodaniu soli chaotropowych, lizat przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej lub wodą (ph 7,0-9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, QPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia.
DNA YEAST KIT V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA YEAST testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcjach PCR i QPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU Materiał wyjściowy Płynna lub powierzchniowa hodowla drożdży bądź mrożony osad komórkowy. Wydajność izolacji Liczba komórek: 1 x 10 8 p 100% Liczba komórek: 2 x 10 8 9 x 10 8 p 30-70% Pojemność złoża ok. 40 µg DNA Czas izolacji ok. 75 minut Czystość DNA A 260 /A 280 = 1,7-2,0 VII. środki ostrożności Hodowla drożdży jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na zawartość mikroorganizmów potencjalnie patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z hodowlami mikroorganizmów należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. www.dnagdansk.com
Nr kat. EM10 Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej mikroorganizmy, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć wodnym roztworem detergentu. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Materiał Wydajność izolacji i jakość wyizolowanego DNA mogą zależeć od: ilości komórek w materiale wyjściowym, typu komórki (morfologia), obecności antybiotyków w pożywce, rodzaju pożywki, a także fazy wzrostu, wieku i stanu komórek drożdżowych. Zestaw przeznaczony jest do izolacji DNA maksymalnie z 1 x 10 8 komórek drożdżowych. Użycie większej liczby komórek może spowodować drastyczny spadek wydajności izolacji oraz czystości wyizolowanego DNA. Zaleca się prowadzenie izolacji ze świeżej hodowli lub mrożonych osadów komórkowych. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania materiału przed izolacją DNA. Użycie starego bądź wielokrotnie rozmrażanego materiału może skutkować niską wydajnością izolacji wysokocząsteczkowego DNA. Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od liczby komórek użytych do izolacji oraz od oczekiwanego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 50-100 μl Elution Buffer przy izolacji maksymalnie z 1 x 10 8 komórek drożdżowych oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego do 200 μl w przypadku większej liczby komórek. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt. 19-21 Protokołu izolacji DNA (sekcja XII), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer zawiera 0,5 mm EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA). Do
DNA YEAST KIT elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mm Tris-HCl, ph 8,0-9,0 lub innych buforów do celów specjalnych, o ph i stężeniu soli zbliżonych do tego buforu. Dodatek czynników redukujących Aby wspomóc proces lizy ściany komórkowej drożdży do buforu do sferoplastów YS Buffer należy dodać β-markaptoetanol (β-me) lub ditreitol (DTT). Związki te są związkami redukującymi mostki dwusiarczkowe i stanowią, oprócz Lysis Mix, dodatkowy czynnik wspomagający dezintegrację ściany komórkowej drożdży. Dodatek czynnika redukującego jest opcjonalny w protokole izolacji. Przygotowanie YS Buffer W przypadku izolacji z większej ilości próbek wygodniej jest przygotować wcześniej bufor do sferoplastów YS Buffer z dodatkiem β-me lub DTT. W tym celu należy odlać odpowiednią ilość YS Buffer do probówki lub falkonu, tak aby wystarczyło do przeprowadzenia danej liczby izolacji. Na każdy 1 ml buforu należy dodać 1 μl 14 M β-me lub 50 μl 1 M DTT i dokładnie wymieszać. Przygotowane osady zawiesić w 200 μl przygotowanego buforu YS Buffer, dodać 2 μl Lysis Mix, 4 μl RNase A i wymieszać przez worteksowanie. Kontynuować izolację od pkt. 4 Protokołu izolacji DNA (sekcja XII). IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Izolacja DNA z hodowli płynnej (0,2 3 ml) Przed pobraniem odpowiedniej objętości hodowli płynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do 1,5 ml probówki typu Eendorf przenieść żądaną objętość hodowli (maksymalnie 1,5 ml) i wirować przy 5-6 tys. rpm (3-4 tys. g). Zdekantować supernatant. Jeśli istnieje potrzeba izolacji z większej niż 1,5 ml objętości hodowli, do powstałego osadu dodać kolejne 1,5 ml hodowli i powtórzyć wirowanie. Kontynuować izolację od pkt. 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja XII). Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad po wyjęciu z zamrażalnika należy bezzwłocznie zawiesić w 200 μl YS Buffer. Nie należy doprowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji DNA (sekcja XII). Izolacja DNA z hodowli powierzchniowej Do probówki 1,5 ml typu Eendorf przenieść 200 μl YS Buffer. Ezą pobrać obfitą liczbę komórek drożdżowych z płytki Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji DNA (sekcja XII). www.dnagdansk.com
Nr kat. EM10 X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz liofilizatu RNase A w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 3. W przypadku wytrącenia się osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 50-60 C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 30⁰C i 55⁰C. 5. Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 6. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej. 7. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. XI. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. H411 Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. YS Buffer, YL Buffer Lysis Mix YB Buffer YW Buffer Proteinase K Proteinase K Proteinase K Uwaga H315, H319, H335, P261, P305+P351+P338 Niebezpieczeństwo H302, H315, H319, P305+P351+P338 Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, H411, P273, P280, P305+P351+P338 Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P261, P305+P351+P338 Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311 Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311 Uwaga H319, P305+P351+P338
1. DNA YEAST KIT XII. PROTOKÓŁ IZOLACJI DNA 1. Zwirować 1,5 ml hodowli drożdżowej przy 5-6 tys. rpm (3-4 tys. g) przez 5 min. Można użyć większej objętości hodowli. W tym przypadku należy postępować według modyfikacji protokołu opisanej w sekcji IX. Przygotowanie próbki. 2. Supernatant zdekantować, a osad komórkowy dokładnie zawiesić w 200 μl YS Buffer. 3. Dodać 2 μl Lysis Mix, 4 μl RNase A oraz 0,2 μl 14 M β-me (opcjonalnie, nie zawarty w zestawie), a następnie wymieszać przez worteksowanie. Można przygotować odpowiednią ilość buforu YS z dodatkiem β-me przed izolacją. Dokładne instrukcje opisane są w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. Alternatywnie do β-me można dodać 10 μl 1 M DTT. Można także pominąć dodatek związku redukującego, jednak odczynnik Lysis Mix nie będzie wtedy działał z maksymalną wydajnością. 4. Inkubować 30 min w temp. 30 C, mieszając co 8-10 min przez odwracanie. 5. Po inkubacji wirować próbkę 2-8 min przy 4,5 tys. rpm (1 tys. g). 6. Ostrożnie usunąć supernatant pipetą. Zwrócić szczególną uwagę, aby nie naruszyć osadu sferoplastów. 7. Osad dokładnie zawiesić w 200 μl YL Buffer. 8. Dodać 10 μl Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie. 9. Inkubować 10 min w temp. 55 C. 10. Dodać 350 μl YB Buffer i dokładnie wymieszać. 11. Inkubować kolejne 5 min w temp. 55 C. 12. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 s. www.dnagdansk.com
Nr kat. EM10 13. Wirować 2 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 14. Nie naruszając osadu delikatnie przenieść supernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 15. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 16. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego YW Buffer i wirować 30 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 17. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. 18. Dodać do minikolumny 400 μl YW Buffer i wirować 30 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 19. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. 20. Wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. g). 21. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 22. Nanieść 50-100 μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwe jest zwiększenie objętości buforu elucyjnego. Więcej wskazówek dotyczących tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 23. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 24. Wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 25. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub temp. -20 C do czasu dalszych analiz.
DNA YEAST KIT XIII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Niecałkowita liza ściany komórkowej drożdży. Zatkane złoże minikolumny. Niska wydajność izolacji DNA. Prawdopodobna przyczyna Za krótki czas lizy dla danego rodzaju i ilości materiału. Do izolacji wzięto za dużą liczbę komórek. Obniżona wydajność działania roztworu Lysis Mix. Nie dodano czynnika redukującego. Powstała zawiesina DNA, która trudno przechodzi przez złoże. Niecałkowita liza komórek. Materiał o niskiej zawartości komórek drożdżowych. Niecałkowita liza komórek. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph wody (ph <7,0). Niewystarczające zmieszanie lizatu z buforem wiążącym YB Buffer. Obniżona aktywność proteinazy K. Niecałkowite wysuszenie kolumny z resztek buforu płuczącego. Rozwiązanie Należy wydłużyć inkubację w 30 C co najmniej do 60 minut. Należy powtórzyć izolację z mniejszej objętości hodowli. Należy użyć świeżego roztworu Lysis Mix. Upewnić się, że Lysis Mix jest przechowywany w temp. -20 C. Należy powtórzyć izolację upewniając się, że dodano odpowiednią ilość β-me lub DTT. Powtórzyć wirowanie przez 1 min przy maksymalnie 14 tys. rpm (21 tys. x g). Patrz Problem Niecałkowita liza ściany komórkowej drożdży. Zwiększyć objętość hodowli użytej do izolacji do 3 ml lub więcej i/lub zmniejszyć objętość buforu elucyjnego do 20 μl. Patrz Problem Niecałkowita liza ściany komórkowej drożdży. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer (powyżej 10 minut). Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer użytego do elucji do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. Izolację należy powtórzyć zwracając uwagę na całkowite zmieszanie lizatu z YB Buffer przed inkubacją w temp. 55 C (pkt. 8). Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. 20 C. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania na sucho (pkt.17) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. www.dnagdansk.com
Nr kat. EM10 Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie DNA wypływa ze studzienek w żelu agarozowym. Niskie stężenie wyizolowanego DNA. Wyizolowane DNA jest podegradowane. Niecałkowita degradacja RNA. Reakcje enzymatyczne z użyciem wyizolowanego DNA nie zachodzą prawidłowo. Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. Obecność alkoholu w próbce. Za duża objętość Elution Buffer. Nieprawidłowe warunki przechowywania materiału. Do izolacji użyto starego materiału. Za krótki czas inkubacji z RNazą A. Obniżona aktywność RNazy A. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Niewystarczająca ilość DNA w eluacie. Duża zawartość RNA w próbce. Niecałkowita degradacja białek w związku z obniżoną aktywnością proteinazy K. Pominięto jeden z dwóch etapów płukania. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Po drugim etapie płukania pamiętać o przeprowadzeniu etapu wirowania na sucho. Objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 30 μl bez obniżenia wydajności elucji. Izolację należy prowadzić ze świeżych lub mrożonych osadów komórkowych. Należy unikać częstego zamrażania i rozmrażania materiału. Zalecana jest izolacja ze świeżej hodowli nocnej. Starsze hodowle mogą zawierać podegradowane DNA. Należy wydłużyć czas inkubacji z RNazą A (pkt. 4) do 30 min. Izolację należy powtórzyć dodając świeży roztwór RNazy A. Upewnić się, że RNaza A jest przechowywana w temp. -20 C. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania na sucho (pkt. 17) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. Patrz Problem Niecałkowita liza ściany komórkowej drożdży i Niskie stężenie wyizolowanego DNA. Patrz Problem Niecałkowita degradacja RNA. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. -20 C. Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu etapach płukania. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania na sucho (pkt. 17) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie.
BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80 172 Gdańsk, www.dnagdansk.com T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: info@dnagdansk.com www.dnagdansk.com