Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0117

Transkrypt

1 Plasmid Midi AX Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja izolacji Nr kat Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 200 µg. 1

2 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny Plasmid szt. +4 do +8 ºC Probówki odbieralnikowe 50 ml 10 szt. Temp. Pok. Wkłady filtrujące 10 szt. Temp. Pok. Kolumna równoważąca 1 szt. Temp. Pok. L1 roztwór z barwnikiem do zawieszania komórek 55 ml Temp. Pok. L2 roztwór lizujący 55 ml Temp. Pok. L3 roztwór zobojętniający 55 ml Temp. Pok. K2P roztwór płuczący 220 ml Temp. Pok. K3 roztwór elucyjny 90 ml Temp. Pok. TE bufor 16 ml Temp. Pok. Wzmacniacz precypitacji 350 µl Temp. Pok. Izopropanol 60 ml Temp. Pok. Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji plazmidowego DNA 2. Etanol 70% 3. Wirówka 4. Woda jałowa (wolna od nukleaz, traktowana DEPC) (nr kat , ) (opcjonalnie) 5. Jałowe probówki o poj. 15 ml i 50 ml typu Falcon UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zalecamy oczyszczenie powierzchni roboczej używając produktu LabZAP (nr kat ) Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji plazmidowego DNA w wypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn 2

3 Protokół izolacji Uwagi: 1. Zestaw zawiera barwny system LySee, który umożliwia łatwą i wygodną kontrolę etapów lizy alkalicznej (więcej informacji - str. 6). 2. W roztworze lizującym L2 znajduje się SDS, który precypituje w niskich temperaturach. Dlatego, jeżeli roztwór lizujący L2 nie jest klarowny, należy go ogrzać w temp. 40 ºC do uzyskania całkowitej klarowności. 1. Zwirować do 100 ml ( ml) nocnej hodowli bakteryjnej. Supernatanty usunąć, a osady dokładnie zawiesić w 5 ml roztworu L1 do zawieszania komórek. W trakcie zawieszania osadu bakteryjnego roztwór będzie zmieniał wygląd z całkowicie transparentnego o odcieniu ciemnoróżowym na nieprzezroczysty o odcieniu jasnoróżowym. Zawieszanie można zakończyć po całkowitym zniknięciu osadu u dołu probówki. 2. Dodać po 5 ml alkalicznego roztworu lizującego L2 i ostrożnie wymieszać do całkowitej lizy. Pozostawić na 5 min w temp. pokojowej. Po dodaniu roztworu lizującego L2, należy ostrożnie mieszać zawartość probówki, aby nie spowodować fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarczy sześciokrotne odwrócenie probówki. Mieszanina powinna zmieniać wygląd i zabarwienie. Po 3 min inkubacji, lizat powinien być całkowicie klarowny i jednolicie malinowy. Jeżeli nie jest, należy wymieszać lizat kilka razy i przedłużyć czas inkubacji o dalsze 3 min. 3. Dodać po 5 ml roztworu zobojętniającego L3 i ostrożnie wymieszać, aż do zniknięcia malinowej barwy lizatów. Po dodaniu roztworu zobojętniającego L3, następuje gwałtowna precypitacja potasowych soli SDS oraz chromosomalnego DNA i niektórych białek. Po wymieszaniu zawartość probówki powinna zmienić zabarwienie na lekko żółte. Brak śladów malinowego zabarwienia wskazuje na całkowite zobojętnienie i pomyślne zakończenie lizy alkalicznej. 4. Lizaty przelać do wkładów filtrujących będących w probówkach 50 ml. Probówki wraz z wkładami zakręcić i wirować przez 5 min przy 1500 x g. 5. Podczas wirowania lizatów, przygotować kolumny Plasmid 200 przez umieszczenie ich w probówkach odbieralnikowych 50 ml (w zestawie). 3

4 6. Nanieść klarowne lizaty (z punktu 4) na przygotowane uprzednio kolumny Plasmid 200 (z punktu 5). Poczekać, aż lizaty wypłyną z kolumn Plasmid Nanieść na kolumny Plasmid 200 po 20 ml roztworu płuczącego K2P. Poczekać, aż roztwory wypłyną z kolumn Plasmid 200. Należy obserwować, czy roztwór w całości przeszedł przez kolumnę. Gdy roztwór przestanie kapać z kolumny należy przejść do kolejnego punktu. 8. Przenieść kolumny Plasmid 200 do nowych probówek typu Falcon 50 ml (nie ma w zestawie). Nanieśc na kolumny Plasmid 200 po 6 ml roztworu elucyjnego K3. Poczekać, aż eluaty wypłyną z kolumn Plasmid Przenieść eluaty do nowych probówek 15 ml, wytrzymujących przyspieszenie minimum x g (nie ma w zestawie). Dodać do eluatów po 25 µl wzmacniacza precypitacji i 5 ml Izopropanolu. W sytuacjach, w których nie ma konieczności lub nie jest pożądane dodawanie wzmacniacza precypitacji, należy dodać jedynie 5 ml izopropanolu. Nie wpłynie to na obniżenie efektywności izolacji. 10. Całość wymieszać i wirować przez 10 min przy x g. 11. Ostrożnie zlać supernatanty, aby nie usunąć niebieskich osadów plazmidowego DNA. W trakcie zlewania supernatantu bardzo łatwo wylać osad plazmidowego DNA. Dla bezpieczeństwa zaleca się wylewać supernatant do przygotowanej probówki, tak aby można było go odzyskać. Dodać po 2 ml 70% etanolu (nie ma w zestawie), lekko zamieszać i wirować przez 3 min przy x g. 4

5 12. Ostrożnie zlać supernatanty, tak aby nie usunąć niebieskich osadów plazmidowego DNA. W trakcie zlewania supernatantu bardzo łatwo wylać osad plazmidowego DNA. Dla bezpieczeństwa zaleca się wylewać supernatant do przygotowanej probówki, tak aby można było go odzyskać. Następnie osady plazmidowego DNA suszyć przez 10 min w temp. pokojowej przez odwrócenie probówek. 13. Po tym czasie zawiesić DNA w 0,2-1 ml buforu TE (w zestawie) lub wody jałowej (nie ma w zestawie). Próbki plazmidowego DNA przechowywać w temp. +4 do +8 ºC do czasu dalszych analiz. 5

6 System LySee System LySee umożliwia łatwą i wygodną kontrolę etapów lizy alkalicznej. Dzięki kontroli wizualnej, umożliwia wyeliminowanie ewentualnych błędów jak: niecałkowite zawieszenie komórek, nieefektywna liza komórek i niepełna precypitacja niepożądanych składników komórkowych. Bezpośrednia kontrola wizualna procesu zawieszenia komórek, lizy, zobojętniania i precypitacji: 1. Zawieszanie i liza: Dodanie do osadu komórek bakteryjnych przejrzystego purpurowego roztworu L1 sprawia, że osad jest łatwy do zlokalizowania (rys. 1). Podczas procesu zawieszania, mieszanina staje się mętna o jasnoróżowym odcieniu (rys. 2). Etap zawieszanie jest zakończony, gdy osad komórek bakteryjnych na dnie probówki całkowicie zniknie. Po dodaniu roztworu lizującego L2 i inkubacji lizat staje się malinowy. Liza komórek jest zakończona, gdy roztwór osiągnie jednorodnie przejrzysty malinowy wygląd (rys. 3). rys. 1 rys. 2 rys Zobojętnianie i precypitacja: Dodanie do mieszaniny roztworu zobojętniającego L3 powoduje gwałtowną precypitację potasowych soli SDS, chromosomalnego DNA i niektórych białek (rys. 4). Po wymieszaniu mieszanina staje się lekko żółta (rys. 5). Brak śladów malinowego zabarwienia wskazuje na całkowite zobojętnienie i pomyślne zakończenie lizy alkalicznej (rys. 6). rys. 4 rys. 5 A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia rys. 6 NIP

7 Produkty powiązane Produkt Ilość Nr kat. Plasmid Mini 50 izolacji izolacji Plasmid Mini AX 50 izolacji Plasmid Mini AX Gravity 100 izolacji Plasmid Maxi AX Sil 2 izolacje S E.coli Transformer Kit 6x40 reakcji Saccharomyces Transformer Kit 120 reakcji Pichia Transformer Kit 120 reackji KineX OverLap Assembly Ligaza T4 DNA 20 reakcji reakcji reakcji reakcji U U

8 Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Izopropanol H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO L2 roztwór lizujący H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. NIEBEZPIECZEŃSTWO L3 roztwór zobojętniający H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenia oczu. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy. UWAGA K2P roztwór płuczący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. NIEBEZPIECZEŃSTWO K3 roztwór elucyjny H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. 8