Zestaw do izolacji DNA z różnych próbek w płytkach 96-dołkowych

Transkrypt

1 Nr kat. EM33 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji DNA z różnych próbek w płytkach 96-dołkowych EXTRACTME jest zarejestrowanym znakiem towarowym BLIRT S.A.

2

3 Nr kat. EM33 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME GENOMIC DNA 96-WELL KIT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji genomowego, mitochondrialnego, bakteryjnego lub wirusowego DNA o wysokiej czystości z tkanek stałych (świeżych, mrożonych, utrwalonych w formalinie lub zatopionych w parafinie), płynów fizjologicznych (moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego, płynu z otrzewnej, płynu z jamy opłucnej), świeżej i zamrożonej krwi (ludzkiej i ssaczej), błony śluzowej ludzkiej i zwierzęcej (w tym wymaz z jamy ustnej, nosowej, gardłowej i pochwowej), nasienia, włosów, bakterii, drożdży, ogonów gryzoni, owadów oraz linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 192 IZOLACJE 960 IZOLACJI 1 Warunki przechowywania Nr katalogowy EM EM GL Buffer (Lysis Buffer) 72 ml 360 ml TP Proteinase K * (lyophilized) 1 szt. 5 szt. -20 C 2 Proteinase Buffer 5.8 ml 29 ml TP RNase A ** (lyophilized) 1 szt. 5 szt. -20 C 3 RNase Buffer 920 μl 4.6 ml TP GB Buffer (conc.) *** (Binding Buffer) GW1 Buffer (conc.) *** (Wash Buffer 1) GW2 Buffer (conc.) *** (Wash Buffer 2) 38 ml 184 ml TP 69 ml 2 x 173 ml TP 35 ml 2 x 87 ml TP Elution Buffer 39 ml 5 x 39 ml TP DNA Binding Plates 2 szt. 10 szt. TP Collection Plates 2 szt. 10 szt. TP DNA Elution Plates 2 szt. 10 szt. TP Elution Adhesive Seals 2 szt. 10 szt. TP 1 TP temperatura pokojowa (+15 C do +25 C) 2 Roztwór Proteinase K należy przechowywać w temperaturze -20 C. 3 RNase A w roztworze przechowywana w temperaturze +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeśli wymagane jest przechowywanie RNase A przed dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNase A i przechowywanie w temperaturze -20 C. 3

4 * Przed pierwszym użyciem do probówki zawierającej liofilizat Proteinase K należy dodać 5.8 ml Proteinase Buffer. ** Przed pierwszym użyciem do probówki zawierające liofilizat RNase A należy dodać 920 μl RNase Buffer. *** Przed pierwszym użyciem do GB, GW1 i GW2 Buffer należy dodać odpowiednią ilość % etanolu ( informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 192 IZOLACJI 960 IZOLACJI Nr katalogowy EM EM GB Buffer 38 ml 184 ml Etanol % 57 ml 276 ml Całkowita objętość 95 ml 460 ml GW1 Buffer 69 ml 2 x 173 ml Etanol % 69 ml 2 x 173 ml Całkowita objętość 138 ml 2 x 346 ml GW2 Buffer 35 ml 2 x 87 ml Etanol % 82 ml 2 x 201 ml Całkowita objętość 117 ml 2 x 288 ml Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Data ważności Data ważności zestawu, przechowywanego w odpowiednich warunkach, podana jest na etykietach produktu. Po otwarciu zestaw zachowuje stabilność przez okres 12 miesięcy. 4

5 Nr kat. EM33 III. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY p p p p p p p p p p tkanka stała świeża lub mrożona: 1 20 mg w zależności od rodzaju tkanki (optymalnie 10 mg) tkanka utrwalona w formalinie: 1 20 mg w zależności od rodzaju tkanki (optymalnie 10 mg) tkanka w bloczku parafinowym: 1 20 mg w zależności od rodzaju tkanki (optymalnie 10 mg) linie komórkowe: komórek płyny fizjologiczne (mocz, PMR, płyn z jamy otrzewnej): 1 5 ml włosy: 1 10 mg owady: 1 10 mg bakteryjna lub drożdżowa hodowla płynna, powierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny wymaz z nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny lub nasienia świeża lub zamrożona krew: do 1 ml WYDAJNOŚĆ IZOLACJI up to 20 μg POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 50 μg DNA CZAS IZOLACJI p p ok. 35 minut izolacja z użyciem wirówki (etap lizy nie jest wliczony) ok. 25 minut izolacja z użyciem kolektora próżniowego (etap lizy nie jest wliczony) CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 =

6 IV. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: 1-20 mg w zależności od rodzaju tkanki (optymalnie 10 mg). Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie (mięśnie, wątroba, serce, mózg, nerka, szpik kostny i inne). (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze f r a g m e n t y. P r z e j ś ć d o w y b o r u m e t o d y h o m o g e n i z a c j i ( p o n i ż e j ) l u b p r z e j ś ć do pkt. 1 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). Ciekły azot, suchy lód (LN 2, CO 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 lub CO 2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć. 2. Otrzymany proszek przenieść do studzienki w 96-dołkowej płytce zawierającej 375 μl GL Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). c Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 375 μl GL Buffer i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do studzienki w 96-dołkowej płytce, nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki. Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl GL Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. Po uzyskaniu homogenatu, opłukać końcówkę nożową za pomocą 275 μl GL Buffer, a następnie przenieść całość do studzienki w 96-dołkowej płytce. 3. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). 6

7 Nr kat. EM33 Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych Polecamy użycie probówek z kulkami ceramicznymi (HPLM100, HPLM100a). 1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 150 μl GL Buffer i przenieść pociętą tkankę. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez 30 s przy x g. Procedurę powtórzyć w razie konieczności. c W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki spowodowanej pienieniem buforu probówkę zwirować przez 120 s przy x g. c W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy maksymalnych obrotach. 2. Dodać 225 μl GL Buffer, wymieszać przez pipetowanie. 3. Do probówki dodać 25 μl Proteinase K oraz 4 μl RNase A. Zworteksować przez 20 s. Inkubować 5 min w temp. 37 C. 4. Dodać 400 μl GB Buffer i wymieszać przez worteksowanie 10 s. 5. Wirować przez 120 s przy x g. 6. Przenieś supernatant do studzienki w 96-dołkowej płytce. c Należy ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając końcówkę pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć supernatant. Resztki tkanki powinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie probówki. 7. Wirować 1 min przy x g. 8. Przejdź do pkt. 1 Protokołu izolacji z wirowaniem lub kolektorem próżniowym (sekcja VI.II.A lub VI.II.B) B. TKANKA UTRWALONA W FORMALINIE Ilość: 1-20 mg w zależności od rodzaju tkanki (optymalnie 10 mg). Materiał: tkanki zwierzęce przechowywane w 4% formalinie w warunkach chłodniczych przez minimum 60 minut. 1. Usunąć formalinę poprzez dwu- lub trzykrotne przepłukanie tkanki roztworem PBS lub H 2 O. c Formalina jest drażniąca. Nie zaleca się sprawdzania prawidłowości odpłukania formaliny przez wdychanie oparów z probówki. 2. Dalej postępować jak w przypadku tkanek świeżych (sekcja IV.A). 7

8 C. TKANKA ZATOPIONA W PARAFINIE Ilość: 1 20 mg w zależności od rodzaju tkanki (optymalnie 10 mg). Materiał: tkanki zwierzęce zatopione w bloczkach parafinowych według standardowej procedury histologicznej. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Z bloczka parafinowego wyciąć fragment o masie max 10 mg i umieścić w probówce (2 ml). 2. Dodać 1 ml ksylenu. Worteksować przez 30 s. c Ksylen jest toksyczny, drażniący i bardzo palny. Pracować pod włączonym wyciągiem. 3. Wirować 5 min przy x g. Usunąć supernatant przez pipetowanie. 4. Powtórzyć etapy Dodać 1 ml % etanolu. Wymieszać przez pipetowanie lub worteksowanie 15 s. 6. Wirować 120 s przy x g. Usunąć supernatant przez pipetowanie. 7. Powtórzyć etapy Suszyć osad w temp. 50 C w otwartej probówce przez 5-20 min celem pozbycia się etanolu. 9. Dodać 375 μl GL Buffer, wymieszać przez worteksowanie przez 20 s. 10. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). 8

9 Nr kat. EM33 D. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: komórek. Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37 C lub TP. Komórki w pożywce lub PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 500 x g. Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 375 μl GL Buffer. W y mi e sz a ć p r ze z i n t e n s y w n e wo r t e k s ow a ni e 3 0 s, a następnie pipetowanie. c Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 6 ) mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w GL Buffer. Należy wtedy rozpipetować ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet. 3. Całość przenieść do studzienki w 96-dołkowej płytce. 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). 9

10 E. BAKTERIA Ilość: do 10 9 komórek ( 1 ml nocnej hodowli E.coli). Materiał: bakteryjna hodowla płynna, powierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) Izolacja DNA z hodowli płynnej Przed pobraniem odpowiedniej objętości hodowli płynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do 96-dołkowej płytki przenieść żądaną objętość hodowli bakteryjnej i wirować przy 3000 x g przez 5-10 min. Zdekantować supernatant. Osad zawiesić w 375 μl GL Buffer. Kontynuować izolację od pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad należy bezzwłocznie zawiesić w 300 μl GL Buffer. Nie należy doprowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od pkt. 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI.I). Izolacja DNA z hodowli powierzchniowej Do 96-dołkowej płytki przenieść 300 μl GL Buffer. Ezą pobrać obfitą liczbę komórek z podłoża na płytce Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od pkt. 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI.I). Izolacja z bakterii Gram-dodatnich Przed przystąpieniem do izolacji DNA z bakterii Gram-dodatnich próbkę należy poddać działaniu odpowiedniego enzymu. Do izolacji DNA z bakterii z rodzaju Staphylococcus zaleca się stosowanie lizostafyny, a w przypadku bakterii z rodzaju Enterococcus lizozymu. 10

11 Nr kat. EM33 Staphylococcus: 1. Przenieść 10 9 komórek do 96-dołkowej płytki i zwirować przy 3000 x g przez 5-10 min. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** (dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 30 μl *** roztworu lizostafyny 400 U/ml i 4 μl RNase A, Przykleić folię. 4. Dokładnie wymieszać poprzez worteksowanie. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością, ponieważ może to spowodować powstanie osadu komórkowego. 5. Inkubować minut *** w temp. 37 C. 6. Zdjąć folię i dodać 300 μl GL Buffer i 17 μl Proteinase K, ponownie nałożyć folię, dokładnie wymieszać przez worteksowanie. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością. 7. Kontynuować izolację od pkt. 5 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI.I). Enterococcus: 1. Przenieść 10 9 komórek do 96-dołkowej płytki i zwirować przy 3000 x g przez 5 10 min. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** (dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 40 μl roztworu lizozymu (RP138) 100 mg/ml i 4 μl RNase A, Przykleić folię 4. Dokładnie wymieszać poprzez worteksowanie. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością, ponieważ może to spowodować powstanie osadu komórkowego. 5. Inkubować minut w 37 C. 6. Zdjąć folię i dodać 300 μl GL Buffer i 17 μl Proteinase K, ponownie nałożyć folię, dokładnie wymieszać przez worteksowanie. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością. 7. Kontynuować izolację od pkt. 5 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI.I). * W przypadku gęstych hodowli, izolację należy prowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. ** Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0. *** W przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych należy dodać 50 μl preparatu lizostafyny i inkubować 1 godzinę w temp. 37 C. 11

12 F. DROŻDŻE Ilość: do 10 8 komórek. Materiał: drożdżowa hodowla płynna, powierzchniowa bądź mrożony osad drożdżowy. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Przenieść 10 8 komórek do 96-dołkowej płytki i zwirować przy 3000 x g przez 5-10 min. 2. Supernatant zdekantować, a osad komórkowy dokładnie zawiesić w 200 μl YS Buffer (EM10-YS Spheroblast Buffer nie wchodzi w skład zestawu). 3. Dodać U litykazy. Przykleić folię. Dokładnie wymieszać poprzez worteksowanie. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością, ponieważ może to spowodować powstanie osadu komórkowego. 4. Inkubować w 30 C przez co najmniej 30 minut, mieszając od czasu do czasu poprzez odwracanie płytki. 5. Po inkubacji wiruj przez 10 minut przy 3000 x g. 6. Usunąć folię, ostrożnie usunąć supernatant pipetą. Zwrócić szczególną uwagę, aby nie naruszyć osadu sferoplastów. 7. Zawiesić osad w 375 μl GL Buffer. 8. Kontynuować izolację od kroku 2 protokołu izolacji (sekcja VI.I). G. PŁYNY FIZJOLOGICZNE Ilość: do 5 ml płynu. Materiał: mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn z jamy otrzewnej, opłucnej, plwocina. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) c Płyny fizjologiczne są materiałem cennym diagnostycznie, a jednocześnie stanowią duże zagrożenie ze względu na potencjalną zawartość patogenów i/lub komórek nowotworowych. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z tym materiałem. 1. Mocz oraz inne płyny: w zależności od objętości, zwirować w odpowiedniej probówce/falkonie przez 5 min przy 500 x g. Supernatant odrzucić. Plwocina: przed wirowaniem należy dodać odpowiednią ilość środka mukolitycznego (bromheksyna, acetylocysteina). Wirować 5 min przy 3000 x g. Supernatant odrzucić. 2. Osad komórkowy przepłukać za pomocą 1 ml PBS lub soli fizjologicznej, wirować 60 s przy x g. 3. Dodać 375 μl GL Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s. 4. Przesieść całą objętość do 96-dołkowej płytki i przejdź do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI.I) 12

13 Nr kat. EM33 H. KREW Ilość: do 1 ml. Materiał: świeża lub mrożona krew. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) c Krew stanowi duże zagrożenie biologiczne ze względu na potencjalną zawartość patogenów. Podczas pracy z krwią niezbędne jest przestrzeganie wszystkich wymogów bezpieczeństwa dotyczących pracy z materiałem biologicznie niebezpiecznym. 1. Przenieść μl krwi do studzienki w 96-dołkowej płytce i dodać taką samą objętość RBC Lysis Bufor (EM05-RBC - nie wchodzi w skład zestawu). c Na przykład dodaj 200 μl buforu do lizy RBC do 200 μl krwi. Gdy objętość próbki krwi jest mniejsza niż 200 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztworu PBS (nie wchodzi w skład zestawu) do całkowitej objętości 200 μl, a następnie dodać 200 μl buforu RBC Lysis Buffer. 2. Przykleić folię. Dokładnie wymieszać przez odwracanie płytki, aż powstanie klarowny czerwony roztwór. 3. Wirować 10 minut przy 3000 x g. c Nie zaleca się zwiększania prędkości wirowania, gdyż może to utrudnić późniejsze zawieszanie powstałego osadu białych krwinek w buforze lizującym. 4. Usunąć folię i ostrożnie usunąć pipetą supernatant znad osadu białych krwinek. 5. Dokładnie zawiesić osad komórek w 375 μl GL Buffer i dodać 10 μl Proteinase K. 6. Ponownie przykleić folię i wymieszać przez odwracanie płytki lub worteksowanie. Następnie krótko zwirować płytkę. 7. Inkubować w 55 C przez 10 min. 8. Kontynuować izolację od kroku 5 protokołu izolacji (sekcja VI.I). 13

14 I. NASIENIE Ilość: do 150 μl. Materiał: nasienie. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Przenieść 150 μl nasienia do studzienki w 96-dołkowej płytce. c Gdy objętość próbki jest mniejsza niż 150 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztwór PBS (nie wchodzi w skład zestawu) do całkowitej objętości 150 μl. Należy zauważyć, że wydajność izolacji DNA będzie wtedy niższa. 2. Dodać 375 μl GL Buffer, 10 μl Proteinase K i 20 μl 1M DTT. 3. Przykleić folię i worteksować przez 3 s. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością, ponieważ może to spowodować powstanie osadu komórkowego. 4. Inkubować w 55 C przez 30 min, mieszając od czasu do czasu poprzez odwracanie płytki. 5. Kontynuować izolację od kroku 5 protokołu izolacji (sekcja VI.I). J. WYMAZY Materiał: wymazy (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny). (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Końcówkę pałeczki wymazowej z pobranym materiałem biologicznym umieścić w 1.5 ml probówce typu Eppendorf, a następnie odciąć wystającą część pałeczki tak, aby możliwe było swobodne zamknięcie probówki. 2. Dodać 375 μl GL Buffer oraz 10 μl Proteinase K, worteksować 3 s. 3. Inkubować przez 30 min w temperaturze 55 C. Podczas inkubacji kilka razy mieszać próbkę poprzez odwracanie probówki. 4. Dokładnie wycisnąć o ściankę probówki końcówkę pałeczki wymazowej tak, aby odzyskać jak największą ilość lizatu. 5. Odrzucić pałeczkę wymazową. Przenieść lizat do studzienki w 96-dołkowej płytce. 6. Kontynuować izolację od kroku 5 protokołu izolacji (sekcja VI.I). 14

15 Nr kat. EM33 K. WŁOSY Ilość: 1 20 mg włosów (ok sztuk), około 10 mg cebulek włosa. Materiał: włosy, najlepiej z cebulkami lub same cebulki. Tylko cebulki zawierają żywe komórki, natomiast w pozostałej części włosa znajdują się resztki komórek ze zdegradowanym gdna oraz mtdna. Stąd też aplikacje, takie jak PCR lub qpcr, powinny uwzględniać produkty o wielkościach 200 pz. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Cebulki odciąć od włosów i umieścić w studzience 96-dołkowej płytki. Jeśli włosy pozbawione są cebulek, pociąć je na fragmenty o długości maksymalnie 3 mm. 2. Dodać 375 μl GL Buffer, 40 μl 1M DTT oraz 25 μl Proteinase K. c Dodatek DTT jest opcjonalny. Większość rodzajów włosów powinna ulec strawieniu bez dodatku tego odczynnika, jednakże niektóre rodzaje włosów (np. kręcone) zawierają zbyt dużą ilość mostków dwusiarczkowych, uniemożliwiających całkowitą lizę.. 3. Przykleić folię i worteksować przez 3 s. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością, ponieważ może to spowodować powstanie osadu komórkowego. 4. Inkubować minimum 6 h (lub przez noc) w temp. 55 C. Należy okresowo worteksować przez s. Polecany jest termomikser. Po inkubacji płytkę krótko zwirować. 5. Po całkowitym potrawieniu przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). 15

16 L. OWADY Ilość: 1 20 mg (optymalnie 10 mg). Materiał: owady w różnych stadiach rozwoju; świeże, mrożone, utrwalone w formalinie lub etanolu. 1. Owady utrwalone w formalinie lub etanolu przemyć dwukrotnie za pomocą PBS lub dh 2 O, wirować 60 s przy 500 x g. W zależności od stopnia fragmentacji utrwalonego materiału przejść do pkt. 3 lub przeprowadzić etap homogenizacji (pkt. 2). 2. Homogenizacja pociąć owady na jak najmniejsze fragmenty. Ucierać w moździerzu w ciekłym azocie na proszek, następnie przenieść do probówki (2 ml). Można także zastosować kulki ceramiczne (według procedury opisanej w pkt. IV). c W celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej. 3. Dodać 375 μl GL Buffer, intensywnie worteksować przez 60 s. 4. Przenieść całą objętość do studzienki w 96-dołkowej płytce 5. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. 6. Przykleić folię i worteksować przez 20 s. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością. 7. Inkubować w temp. 37 C przez 5 min, następnie w temp. 55 C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h przy dobrej homogenizacji lub 5 16 h przy pracy na pociętych fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. Po inkubacji krótko zwirować. 8. Przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). 16

17 Nr kat. EM33 M. OGONY GRYZONI Ilość: do 20 mg (optymalnie 10 mg). Materiał: ogon szczura lub myszy. (przygotowanie na 1 minikolumnę w 96-dołkowej płytce) 1. Ogon pociąć nożyczkami lub skalpelem na jak najmniejsze fragmenty i umieścić w studzience 96-dołkowej płytki. c W celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej (patrz pkt. IV). 2. Dodać 375 μl GL Buffer, 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. 3. Przykleić folię i worteksować przez 20 s. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii. c Nie zaleca się intensywnego wirowania z dużą prędkością. 4. Inkubować w temp. 37 C przez 5 min, następnie w temp. 55 C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h przy dobrej homogenizacji lub 5 16 h przy pracy na pociętych fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. Po inkubacji krótko zwirować. 5. Przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja VI.I). V. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer). 3. W razie potrzeby przygotować roztwór RNase A poprzez rozpuszczenie liofilizatu w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 4. Należy upewnić się czy do GB, GW1 i GW2 Buffers dodany został etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 5. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (GB, GW1 i GW2 Buffers) lub C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 6. Nagrzać termoblok, termomikser lub łaźnię wodną do temp. 70 C. 7. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 17

18 VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI I. Przygotowanie lizatów: 1. Umieścić odpowiednio przygotowany materiał biologiczny * w każdej studzience 96-dołkowej płytki. Dodać 375 μl GL Buffer. 2. Dodać 25 μl Proteinase K do każdej studzienki i przykleić folię. Dobrze wymieszać poprzez worteksowanie przez 20 s. Krótko zwirować w celu zebrania lizatu z folii c Intensywne wirowanie nie jest zalecane. 3. Inkubować w 55 C, aż materiał zostanie całkowicie strawiony. Energicznie worteksować przez 20 s co min. c W przypadku większych fragmentów tkanek można wykonać trawienie przez noc. 4. Opcjonalnie dodać RNase A, w tym celu usuń folię, nanieś 4 μl RNase A do każdej studzienki i ponownie zaklej płytkę. Dobrze wymieszać przez worteksowanie i krótko odwirować płytkę. Inkubować w 37 C przez 5 min. c Intensywne wirowanie nie jest zalecane. 5. Usunąć folię i dodać 400 μl GB Buffer. Zakleić płytkę i dokładnie mieszać przez 10 s, aby uzyskać jednorodny roztwór. 6. Wirować przez 5 10 minut przy 3000 x g. 7. Przejść natychmiast do protokołu izolacji z wirowaniem (sekcja VI.IIA) lub z użyciem kolektora próżniowego (sekcja VI.IIB). II.A Izolacja z wirowaniem: 1. Umieścić DNA Binding Plate na Collection Plate. 2. Usunąć folię z płytki. Ostrożnie przenieść połowę supernatantu ( 350 μl) zawierającego genomowe DNA do studzienek w DNA Binding Plate. c Należy uważać, aby przenieść jedynie supernatant zawierający genomowe DNA i nie naruszyć osadu zawierającego pozostałości komórkowe. Nieużywaną część płytki zakryć folią. * Patrz sekcja IV. Przygotowanie próbki. 3. Wirować przez 5 10 min z minimalną prędkością 3000 x g. Odrzucić filtrat i użyć ponownie Collection Plate. c Jeśli supernatant w całości nie przeszedł przez membranę, należy powtórzyć wirowanie przez 2 5 min przy 3000 x g. Jeśli problem utrzyma się, oznacza to, że materiał był niewystarczająco zhomogenizowany bądź czas trawienia próbki podczas izolacji był zbyt krótki lub zbyt długi. 18

19 Nr kat. EM33 4. Przenieść pozostałą część supernatantu do tej samej studzienki w DNA Binding Plate. 5. Wirować przez 5 10 minut przy minimum 3000 x g. Wylać przesącz z Collection Plate i ponownie umieścić w niej DNA Binding Plate. 6. Dodać 600 μl GW1 Buffer i wirować przez 120 s przy minimum 3000 x g. Wylać przesącz z Collection Plate i ponownie umieścić w niej DNA Binding Plate. 7. Dodać 500 μl GW2 Buffer i wirować przez 120 s przy minimum 3000 x g. Wylać przesącz z Collection Plate i ponownie umieścić w niej DNA Binding Plate. 8. Wirować przez 20 min przy minimum 3000 x g lub umieścić DNA Binding Plate w cieplarce o temperaturze 70 C na 10 min w celu odparowania pozostałości alkoholu. c Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. c Aby zapewnić całkowite wyschnięcie membrany nie zaklejać płytki. c Usuwanie alkoholu przez odparowanie w temperaturze 70 C jest bardziej wydajne niż długie odwirowywanie. 9. Odrzucić Collection Plate oraz przesącz. Ostrożnie przenieść DNA Binding Plate w DNA Elution Plate. 10. Nanieść μl Elution Buffer centralnie na złoże w minikolumnie. c Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie μl. 11. Całość inkubować z buforem przez 120 s w temperaturze pokojowej. 12. Wirować 120 s przy 3000 x g. 13. DNA Binding Plate usunąć, a następnie szczelnie zakleić DNA Elution Plate za pomocą Elution Adhesive Seal. Wyizolowane DNA przechowywać w temperaturze +4 C lub -20 C w zależności od dalszych analiz. 19

20 VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI II.B Izolacja z użyciem kolektora próżniowego 1. Przygotuj kolektor próżniowy zgodnie z instrukcją producenta. c Jeśli korzystasz z automatycznej stacji roboczej do obsługi cieczy, przygotuj stację roboczą zgodnie z zaleceniami producenta. 2. Umieścić DNA Binding Plate na górze kolektora. 3. Ostrożnie przenieść połowę supernatantu ( 350 μl) zawierającego genomowe DNA do studzienek w DNA Binding Plate Binding Plate. c Należy uważać, aby przenieść jedynie supernatant zawierający genomowe DNA i nie naruszyć osadu zawierającego pozostałości komórkowe. Nieużywaną część płytki zakryć folią. 4. Włączyć próżnię na s, aż lizat przejdzie przez DNA Binding Plate. Wyłączyć próżnię. 5. Przenieść pozostałą mieszaninę do tej samej studzienki na DNA Binding Plate. 6. Włączyć próżnię na s, aż lizat przejdzie przez DNA Binding Plate. Wyłączyć próżnię. 7. Dodać 600 μl GW1 Buffer do każdej studzienki w DNA Binding Plate. 8. Włączyć próżnię na 120 s. Wyłączyć próżnię. 9. Dodać 500 μl GW2 Buffer do każdej studzienki w DNA Binding Plate. 10. Włączyć próżnię na 120 s. Wyłączyć próżnię. 11. Umieścić DNA Binding Plate na stosie ręczników papierowych i delikatnie stuknij, aby usunąć resztki cieczy z dysz. Ponownie umieścić DNA Binding Plate w kolektorze próżniowym. 20

21 Nr kat. EM Włączyć próżnię na 10 minut lub umieścić DNA Binding Plate w cieplarce o temperaturze 70 C na 10 min w celu odparowania pozostałości alkoholu. c Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. c Aby zapewnić całkowite wyschnięcie membrany nie zaklejać płytki. c Usuwanie alkoholu przez odparowanie w temperaturze 70 C jest bardziej wydajne niż długie odwirowywanie. 13. Rozmontować kolektor próżniowy, aby wyjąć tacę na odpady. Wyrzucić filtrat. 14. Złożyć kolektor próżniowy razem z DNA Elution Plate. 15. Umieścić DNA Binding Plate na kolektorze próżniowym. 16. Dodać μl Elution Buffer, centralnie na środek minikolmny. c Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie μl. 17. Inkubować DNA Binding Plate w temperaturze pokojowej przez 120 sekund. 18. Włączyć próżnię na 120 s. Wyłączyć próżnię. 19. Zdemontować kolektor próżniowy w celu usunięcia DNA Elution Plate, następnie zakleić DNA Elution Plate za pomocą Elution Adhesive Seal. Wyizolowane DNA przechowywać w temperaturze +4 C lub -20 C w zależności od dalszych analiz. 21

22 VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Proteinase K (lyophilized) Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335 P261, P271, P304+P340, P342+P311 GL Buffer Uwaga H319 P264, P305+P351+P338 GB Buffer GW1 Buffer Niebezpieczeństwo H318, H302, H332, H315, H412 P280, P261, P305+P351+P338, P301+P312 P330, P304+P340 P312 Niebezpieczeństwo H318, H315, H412 P280, P305+P351+P338 P310 H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H332 Działa szkodliwie w następstwie wdychania. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P261 Unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy. P264 Dokładnie umyć ręce po użyciu. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. P280 Stosować rękawice ochronne / odzież ochronną / ochronę oczu / ochronę twarzy. P305+P351+P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 22

23 Nr kat. EM33 P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P304+P340 W przypadku dostania się do dróg oddechowych: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. P312 W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P301+P312 P330 W przypadku połknięcia: W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. Wypłukać usta. P310 Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. 23

24