Zestaw do izolacji DNA z różnych próbek

Transkrypt

1 GENOMIC DNA Nr kat. EM13 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji DNA z różnych próbek EXTRACTME jest zarejestrowanym znakiem towarowym BLIRT S.A.

2 GENOMIC DNA 2

3 Nr kat. EM13 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME GENOMIC DNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji genomowego, mitochondrialnego, bakteryjnego lub wirusowego DNA o wysokiej czystości z tkanek stałych (świeżych, mrożonych, utrwalonych w formalinie lub zatopionych w parafinie), płynów fizjologicznych, (moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego, płynu z otrzewnej, płynu w jamie opłucnej), świeżej i zamrożonej krwi (ludzkiej i ssaczej), błony śluzowej ludzkiej i zwierzęcej (w tym wymaz z jamy ustnej, nosowej, gardłowej i pochwowej), nasienia, włosów, ogonów gryzoni, owadów, bakterii, drożdzy oraz linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI 1 Warunki przechowywania Nr katalogowy EM EM EM GL Buffer (Lysis Buffer) Proteinase K ** (lyophilized) 3.8 ml 19 ml 94 ml TP 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 2 Proteinase Buffer 280 μl 1.4 ml 7 ml TP RNase A * (lyophilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 3 RNase Buffer 100 μl 220 μl 1.1 ml TP GB Buffer (conc.) *** (Binding Buffer) GW1 Buffer (conc.) *** (Wash Buffer 1) GW2 Buffer (conc.) *** (Wash Buffer 2) 1.8 ml 10 ml 44 ml TP 3.3 ml 17 ml 82 ml TP 1.8 ml 9 ml 41 ml TP Elution Buffer 2 ml 10 ml 5 x 10 ml TP DNA Purification Columns 10 szt. 50 szt. 5 x 50 szt. TP Collection Tubes (2 ml) 10 szt. 50 szt. 5 x 50 szt. TP 1 TP temperatura pokojowa (+15 C do +25 C) 2 Roztwór Proteinase K należy przechowywać w temperaturze -20 C. 3 RNase A w roztworze przechowywana w temperaturze +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeśli wymagane jest przechowywanie RNaseA przed dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNase A i przechowywanie w temperaturze -20 C. 3

4 GENOMIC DNA * Przed pierwszym użyciem do probówki zawierające liofilizat RNase A należy dodać 220 μl RNase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 100 μl buforu). ** Do probówki zawierającej liofilizat Proteinase K należy dodać 1.4 ml Proteinase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 280 μl buforu). *** Przed pierwszym użyciem do GB, GW1 i GW2 Buffer należy dodać odpowiednią ilość % etanolu ( informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM EM EM TB Buffer 1.8 ml 10 ml 44 ml Etanol % 2.7 ml 15 ml 66 ml Całkowita objętość 4.5 ml 25 ml 110 ml TW1 Buffer 3.3 ml 17 ml 82 ml Etanol % 3.3 ml 17 ml 82 ml Całkowita objętość 6.6 ml 34 ml 164 ml TW2 Buffer 1.8 ml 9 ml 41 ml Etanol % 4.2 ml 21 ml 96 ml Całkowita objętość 6 ml 30 ml 137 ml Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Data ważności Data ważności zestawu, przechowywanego w odpowiednich warunkach, podana jest na etykietach produktu. Po otwarciu zestaw zachowuje stabilność przez okres 12 miesięcy. 4

5 Nr kat. EM13 III. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY tkanka stała świeża lub mrożona: 1 30 mg tkanka utrwalona w formalinie: 1 30 mg tkanka w bloczku parafinowym: 1 30 mg linie komórkowe: komórek płyny fizjologiczne (mocz, PMR, płyn otrzewnowy): 1 5 ml włosy: mg owady: 1 30 mg bakteryjna lub drożdżowa hodowla płynna, powierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny wymaz z nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny lub nasienia świeża lub zamrożona krew: do 1 ml WYDAJNOŚĆ IZOLACJI ng/ µl (w zależności od rodzaju i masy tkanki użytej do izolacji) POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 50 µg DNA CZAS IZOLACJI ok. 12 minut (po etapie lizy) minut na przygotowanie próbki CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1,7 1,9 5

6 GENOMIC DNA IV. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: 1 30 mg. Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie (mięśnie, wątroba, serce, mózg, nerka, szpik kostny i inne). Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze f r a g m e n t y. P r z e j ś ć d o w y b o r u m e t o d h o m o g e n i z a c j i ( p o n i ż e j ) l u b p r z e j ś ć do pkt. 1 Protokołu izolacji (sekcja VI). Ciekły azot, suchy lód (LN 2, CO 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 lub CO 2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć. 2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 375 μl GL Buffer i przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). ccjeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 375 μl GL Buffer i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki (2 ml), nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki. Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl GL Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. P o u z y s k a n i u h o m o g e n a t u, o p ł u k a ć k o ń c ó w k ę n o ż o w ą z a p o m o c ą 275 μl GL Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml). 3. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych (polecamy zestaw EXTRACTME DNA TISSUE PLUS, nr kat. EM04, w skład którego wchodzą dodatkowo probówki z kulkami Bead Beating Tubes) 1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 150 μl GL Buffer i przenieść pociętą tkankę. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez 30 s przy x g. Procedurę powtórzyć w razie konieczności. ccw przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki spowodowanej pienieniem buforu probówkę zwirować przez 120 s przy x g. ccw przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; min. 5 min przy maksymalnych obrotach. 6

7 Nr kat. EM13 2. Dodać 225 μl GL Buffer, wymieszać przez pipetowanie. 3. Do probówki dodać 25 μl Proteinase K oraz 4 μl RNase A. Zworteksować przez 20 s. Inkubować 5 min w temp. 37 C. 4. Przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). B. TKANKA UTRWALONA W FORMALINIE Ilość: 1 30 mg. Materiał: tkanki zwierzęce przechowywane w 4% formalinie w warunkach chłodniczych przez minimum 60 minut. 1. Usunąć formalinę poprzez dwu lub trzykrotne przepłukanie tkanki roztworem PBS lub H 2 O. ccformalina jest drażniąca. Nie zaleca się sprawdzania prawidłowości odpłukania formaliny przez wąchanie oparów z probówki. 2. Dalej postępować jak w przypadku tkanek świeżych (sekcja IV.A). C. TKANKA ZATOPIONA W PARAFINIE Ilość: 1 30 mg. Materiał: tkanki zwierzęce zatopione w bloczkach parafinowych według standardowej procedury histologicznej. 1. Z bloczka parafinowego wyciąć fragment o masie max 30 mg i umieścić w probówce (2 ml). 2. Dodać 1 ml ksylenu. Worteksować przez 30 s. ccksylen jest toksyczny, drażniący i bardzo palny. Pracować pod włączonym wyciągiem. 3. Wirować 5 min przy x g. Usunąć supernatant przez pipetowanie. 4. Powtórzyć etapy Dodać 1 ml % etanolu. Wymieszać przez pipetowanie lub worteksowanie 15 s. 6. Wirować 120 s przy x g. Usunąć supernatant przez pipetowanie. 7. Powtórzyć etapy Suszyć osad w temp. 50 C w otwartej probówce przez 5-20 min celem pozbycia się etanolu. 9. Dodać 375 μl GL Buffer, wymieszać przez worteksowanie przez 20 s. 10. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). 7

8 GENOMIC DNA D. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: komórek. Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. 1. Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37 C lub TP. Komórki w pożywce lub PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy x g. Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 375 μl GL Buffer. W y m i e s z a ć p r z e z i n t e n s y w n e w o r t e k s o w a n i e 3 0 s, a następnie pipetowanie. ccdla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 7 ) mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w GL Buffer. Należy wtedy rozpipetować ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet. 3. Całość przenieść do nowej probówki (2 ml). 4. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). E. BAKTERIA Ilość: ml (do 10 9 komórek) Materiał: bakteryjna hodowla płynna, powierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny. Izolacja DNA z hodowli płynnej (0.2 3 ml) Przed pobraniem odpowiedniej objętości hodowli płynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do 1.5 ml probówki typu Eendorf przenieść żądaną objętość hodowli bakteryjnej (maksymalnie 1.5 ml) i wirować przy x g. Zdekantować supernatant. Jeśli istnieje potrzeba izolacji z większej niż 1,5 ml objętości hodowli, do powstałego osadu dodać kolejne 1.5 ml hodowli i powtórzyć wirowanie. Osad zawiesić w 375 µl GL Buffer. Kontynuować izolację od kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). Izolacja DNA z dużej liczby komórek W przypadku izolacji DNA z dużej liczby komórek ( 10 9 ), powstały po zwirowaniu osad należy dokładnie zawiesić w 450 μl GL Buffer oraz zmienić ilości dodawanych enzymów odpowiednio do 6 μl w przypadku RNase A (krok 1c) oraz 15 μl w przypadku Proteinase K (krok 1b Protokołu izolacji, sekcja VI). 8

9 Nr kat. EM13 Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad należy bezzwłocznie zawiesić w 300 μl GL Buffer. Nie należy doprowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od kroku 1b Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Izolacja DNA z hodowli powierzchniowej Do probówki 1.5 ml typu Eendorf przenieść 300 μl GL Buffer. Ezą pobrać obfitą liczbę komórek z podłoża na płytce Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od kroku 1b Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Izolacja z bakterii Gram-dodatnich Przed przystąpieniem do izolacji DNA z bakterii Gram-dodatnich próbkę należy poddać działaniu odpowiedniego enzymu. Do izolacji DNA z bakterii z rodzaju Staphylococcus zaleca się stosowanie lizostafyny, a w przypadku bakterii z rodzaju Enterococcus lizozymu. Staphylococcus: 1. Odwirować 1.5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** ( dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 30 μl roztworu lizostafyny 400 U/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować minut *** w 37 C. 5. Dodać 300 μl GL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać przez worteksowanie. 6. Inkubować w 55 C przez 10 min. 7. Kontynuować izolację od kroku 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Enterococcus: 1. Odwirować 1.5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** ( dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 40 μl roztworu lizozymu 100 mg/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować minut w 37 C. 5. Dodać 300 μl GL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać. 6. Inkubować w 55 C przez 10 min. 7. Kontynuować izolację od kroku 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). * ** W przypadku gęstych hodowli, izolację należy prowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0. *** W przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych należy dodać 50 μl preparatu lizostafyny i inkubować 1 godzinę w temp. 37 C. 9

10 GENOMIC DNA F. DROŻDŻE Ilość: ml (do 10 8 komórek). Materiał: Drożdżowa hodowla płynna, powierzchniowa bądź mrożony osad drożdżowy. 1. Zwirować 1.5 ml hodowli drożdżowej przy x g przez 5 min. 2. Supernatant zdekantować, a osad komórkowy dokładnie zawiesić w 200 μl YS Buffer (EM10-YS Spheroblast Buffer nie wchodzi w skład zestawu). 3. Dodać U litykazy i wymieszaj poprzez worteksowanie. 4. Inkubować w 30 C przez co najmniej 30 minut, mieszać od czasu do czasu poprzez odwracanie probówki. 5. Po inkubacji wiruj przez 10 minut przy 1000 x g. 6. Ostrożnie usunąć supernatant pipetą. Zwrócić szczególną uwagę, aby nie naruszyć osadu sferoplastów. 7. Kontynuować izolację od kroku 1 protokołu izolacji (sekcja VI). G. PŁYNY FIZJOLOGICZNE Ilość: do 5 ml płynu. Materiał: mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn z jamy otrzewnej, opłucnej, plwocina. ccpłyny fizjologiczne są materiałem cennym diagnostycznie, a jednocześnie stanowią duże zagrożenie ze względu na potencjalną zawartość patogenów i/lub komórek nowotworowych. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z tym materiałem. 1. Mocz oraz inne płyny: w zależności od objętości, zwirować w odpowiedniej probówce/falkonie przez 5 min przy 500 x g. Supernatant odrzucić. Plwocina: przed wirowaniem należy dodać odpowiednią ilość środka mukolitycznego (bromheksyna, acetylocysteina). Wirować 5 min przy 3000 x g. Supernatant odrzucić. 2. Osad komórkowy przepłukać za pomocą 1 ml PBS lub soli fizjologicznej, wirować 60 s przy 3000 x g. 3. Dodać 375 μl GL Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s. 4. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). 10

11 Nr kat. EM13 H. KREW Ilość: do 1 ml. Materiał: świeża lub mrożona krew. 1. Przenieść μl krwi do sterylnej probówki Eendorf 1,5 2 ml i dodać taką samą objętość buforu RBC Lysis Bufor (EM05-RBC nie wchodzi w skład zestawu). Na przykład dodaj 200 μl buforu do lizy RBC do 200 μl krwi. Gdy objętość próbki krwi jest mniejsza niż 200 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztworu PBS (nie wchodzi w skład zestawu) do całkowitej objętości 200 μl, a następnie dodać 200 μl buforu RBC Lysis Buffer. 2. Dokładnie wymieszać przez odwracanie probówki, aż powstanie klarowny czerwony roztwór. 3. Wirować 4 minuty przy 8600 x g. ccnie zaleca się zwiększania prędkości wirowania, gdyż może to utrudnić późniejsze zawieszanie powstałego osadu białych krwinek w buforze lizującym. 4. Ostrożnie usunąć pipetą supernatant znad osadu białych krwinek. 5. Dokładnie zawiesić osad komórek w 375 μl GL Buffer i worteksować przez 20 sekund. 6. Dodać 10 μl Proteinase K i wymieszać poprzez kilkukrotnie odwracanie probówki lub worteksowanie. 7. Inkubować w 55 C przez 10 min. 8. Kontynuować izolację od kroku 2 protokołu izolacji (sekcja VI). I. NASIENIE Ilość: do 150 μl. Materiał: nasienie. 1. Przenieść 150 μl nasienia do sterylnej probówki Eendorf ml. ccgdy objętość próbki jest mniejsza niż 150 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztwór PBS (nie wchodzi w skład zestawu) do całkowitej objętości 150 μl. Należy zauważyć, że wydajność izolacji DNA będzie wtedy niższa. 2. Dodać 375 μl GL Buffer, 10 μl Proteinase K i 20 μl 1M DTT, worteksować przez 3 s. 3. Inkubować w 55 C przez 30 min, mieszając od czasu do czasu poprzez odwracanie probówki. 4. Kontynuować izolację od kroku 2 protokołu izolacji (sekcja VI). 11

12 GENOMIC DNA J. WYMAZY Materiał: wymazy (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny). 1. Końcówkę pałeczki wymazowej z pobranym materiałem biologicznym umieścić w 1.5 ml probówce typu Eendorf, a następnie odciąć wystającą część pałeczki tak, aby możliwe było swobodne zamknięcie probówki. 2. Dodać 375 μl GL Buffer oraz 10 μl Proteinase K, worteksować 3 s. 3. Inkubować przez 30 min w temperaturze 55 C. Podczas inkubacji kilka razy mieszać próbkę poprzez odwracanie probówki. 4. Dokładnie wycisnąć o ściankę probówki końcówkę pałeczki wymazowej tak, aby odzyskać jak największą ilość lizatu. Odrzucić pałeczkę wymazową. 5. Kontynuować izolację od kroku 2 protokołu izolacji (sekcja VI). K. WŁOSY Ilość: mg włosów (ok sztuk), do 30 mg cebulek włosa. Materiał: włosy, najlepiej z cebulkami lub same cebulki. Tylko cebulki zawierają żywe komórki, natomiast w pozostałej części włosa znajdują się resztki komórek ze zdegradowanym gdna oraz mtdna. Stąd też aplikacje, takie jak PCR lub qpcr, powinny uwzględniać produkty o wielkościach 200 pz. 1. Cebulki odciąć od włosów i umieścić w probówce (2 ml). Jeśli włosy pozbawione są cebulek, pociąć je na fragmenty o długości maksymalnie 3 mm. 2. Dodać 375 μl GL Buffer. Dodać 40 μl 1M DTT oraz 25 μl Proteinase K. Wymieszać przez worteksowanie 30 s. ccdodatek DTT jest opcjonalny. Większość rodzajów włosów powinna ulec strawieniu bez dodatku tego odczynnika, jednakże niektóre rodzaje włosów (np. kręcone) zawierają zbyt dużą ilość mostków dwusiarczkowych, uniemożliwiających całkowite potrawienie samą Proteinase K. 3. Inkubować minimum 6 h (lub przez noc) w temp. 55 C. Należy okresowo worteksować przez s. Polecany jest termomikser. 4. Po całkowitym potrawieniu przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). ccw przypadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji DNA według standardowych procedur. 12

13 Nr kat. EM13 L. OWADY Ilość: 1 30 mg. Materiał: owady w różnych stadiach rozwoju; świeże, mrożone, utrwalone w formalinie lub etanolu. 1. Owady utrwalone w formalinie lub etanolu przemyć dwukrotnie za pomocą 1 ml PBS lub dh 2 O, wirować 60 s przy 500 x g. W zależności od stopnia fragmentacji utrwalonego materiału przejść do pkt. 3 lub przeprowadzić etap homogenizacji (pkt. 2). 2. Homogenizacja pociąć owady na jak najmniejsze fragmenty. Ucierać w moździerzu w ciekłym azocie na proszek, następnie przenieść do probówki (2 ml). Można także zastosować kulki ceramiczne (według procedury opisanej w pkt. IV.A). ccw celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej. 3. Dodać 375 μl GL Buffer, intensywnie worteksować przez 60 s. 4. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w temp. 37 C przez 5 min, następnie w temp. 55 C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h przy dobrej homogenizacji lub 5 16 h przy pracy na pociętych fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 5. Przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). ccw przypadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji DNA według standardowych procedur. 13

14 GENOMIC DNA M. OGONY GRYZONI Ilość: do 30 mg. Materiał: ogon szczura lub myszy. 1. Ogon pociąć nożyczkami lub skalpelem na jak najmniejsze fragmenty i umieścić w probówce (2 ml). ccw celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej (patrz pkt. IV.A). 2. Dodać 375 μl GL Buffer, intensywnie worteksować przez 20 s. 3. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w temp. 37 C przez 5 min, następnie w temp. 55 C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h przy dobrej homogenizacji lub 5 16 h przy pracy na pociętych fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 4. Przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). 14

15 Nr kat. EM13 V. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer). 3. W razie potrzeby przygotować roztwór RNase A poprzez rozpuszczenie liofilizatu w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 4. Należy upewnić się czy do GB, GW1 i GW2 Buffers dodany został etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 5. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (GB, GW1 i GW2 Buffers) lub C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 6. Nagrzać termoblok, termomikser lub łaźnię wodną do temp. 55 C. 7. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 15

16 GENOMIC DNA VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI KROK 1 Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2 ml) µl GL Buffer + 25 µl Proteinase K 55 C min. a. Dodać 375 μl GL Buffer. Worteksować przez 20 s. ccw przypadku pienienia roztworu należy go zwirować przez s przy x g. b. Dodać 25 μl Proteinase K i wymieszać przez odwracanie probówki. Umieścić probówkę w termobloku, termomikserze lub łaźni wodnej w temp. 55 C i inkubować do czasu całkowitego potrawienia materiału biologicznego. Po każdych min probówkę intensywnie worteksować przez 20 s. c. Opcjonalnie dodać 4 μl roztworu RNase A. Inkubować 5 min w temp. 37 C. ccusuwanie RNA zalecane jest szczególnie w przypadku tkanek aktywnych metabolicznie oraz gdy niezbędne jest wyizolowanie DNA całkowicie wolnego od RNA. KROK 2 Dodać 400 μl GB Buffer i wymieszać przez worteksowanie 10 s. Wirować 120 s przy x g x g 120 s x g 60 s Przenieść ostrożnie supernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej, uważając, żeby nie zaciągnąć resztek niepotrawionej tkanki. ccw przypadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych należy ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając końcówkę pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć supernatant. Resztki tkanki powinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie probówki. Wirować 60 s przy x g. cc Po wirowaniu w minikolumnie nie powinno być płynu. W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części minikolumny należy powtórzyć wirowanie przez 120 s przy maksymalnej prędkości. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 16

17 Nr kat. EM13 KROK 3 Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego GW1 Buffer i wirować 30 s przy x g. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. Dodać do minikolumny 500 μl GW2 Buffer i wirować 30 s przy x g. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. Wirować s przy x g. ccbufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1.5 ml typu Eendorf x g 30 s x g s KROK 4 Nanieść μl Elution Buffer centralnie na złoże w minikolumnie. Inkubować minikolumnę z buforem przez 120 s. Wirować 60 s przy x g. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub temp. -20 C w zależności od dalszych analiz x g 60 s 17

18 GENOMIC DNA VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Proteinase K (lyophilized) GL Buffer GB Buffer GW1 Buffer Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335 P261, P264, P271, P280, P305+P351+P338, P337+P313, P304+P340, P342+P311, P312, P302+P352, P332+P313 P362 Uwaga H319 P264, P280, P305+P351+P338, P337+P313 Niebezpieczeństwo H318, H302, H332, H315, H412 P273, P264, P270, P280, P261, P271, P302+P352, P332+P313 P362, P305+P351+P338 P310, P301+P312 P330, P304+P340 P312 Niebezpieczeństwo H318, H302, H315, H412 P273, P264, P270, P280, P302+P352, P332+P313 P362, P305+P351+P338 P310, P301+P312 P330 H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H332 Działa szkodliwie w następstwie wdychania. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P261 Unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/ mgły/par/rozpylonej cieczy. P264 Dokładnie umyć ręce po użyciu. P270 Nie jeść, nie pić ani nie palić podczas używania produktu. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. P273 Nie wypuszczać do środowiska (unikać uwalniania do środowiska). P280 Stosować rękawice ochronne / odzież ochronną / ochronę oczu / ochronę twarzy. 18

19 Nr kat. EM13 P305+P351+P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P337+P313 W przypadku utrzymywania się działania drażniącego na oczy: Zasięgnąć porady/ zgłosić się pod opiekę lekarza. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P304+P340 W przypadku dostania się do dróg oddechowych: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. P312 W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P302+P352 W przypadku kontaktu ze skórą: umyć dużą ilością wody. P332+P313 P362 W przypadku wystąpienia podrażnienia skóry: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. Zanieczyszczoną odzież zdjąć i wyprać przed ponownym użyciem. P301+P312 P330 W przypadku połknięcia: W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. Wypłukać usta. P310 Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. 19

20