Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Transkrypt

1 Nr kat. EM06 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.

2

3 Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji genomowego DNA o wysokiej czystości z ludzkich oraz zwierzęcych wymazów z błon śluzowych (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy) oraz nasienia. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 25 IZOLACJI 100 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM EM EM EM06-D SSL Buffer (Lysis Buffer) 8,8 ml 35,2 ml 88 ml 1,1 ml Proteinase K (lyophilized) 1 szt. 2 szt. 5 szt. 1 szt. Proteinase Buffer 200 µl 640 µl 1,6 ml 200 µl DTT 1 szt. 1 szt. 1 szt. 1 szt. SSB Buffer (Binding Buffer) 8,8 ml 35,2 ml 88 ml 1,1 ml SSW1 Buffer (Wash Buffer 1) 15 ml 60 ml 150 ml 1,8 ml SSW2 Buffer (Wash Buffer 2) 10 ml 40 ml 100 ml 1,2 ml Elution Buffer 5 ml 2 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Proteinaza K dostarczana jest w postaci liofilizowanej. Liofilizat proteinazy K należy przechowywać w temp. +4 C. Przed pierwszym użyciem liofilizat należy rozpuścić w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer), zgodnie z zaleceniami na etykiecie probówki. Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. -20 C! DTT (ditiotreitol) należy przechowywać w temp. -20 C. Przed pierwszym użyciem DTT należy rozpuścić w jałowej wodzie zgodnie z zaleceniami na etykiecie probówki. Roztwór DTT należy przechowywać również w temp. -20 C! 3

4 Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT jałowe pałeczki wymazowe etanol % cz.d.a jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5 2 ml (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) worteks IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA składa się z 4 etapów i jest przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Próbka wymazu lub nasienia poddawana jest lizie enzymatycznej z wykorzystaniem zoptymalizowanego buforu SSL Buffer oraz silnej proteazy (proteinazy K), a w przypadku izolacji DNA z nasienia dodatkowo DTT. W tym etapie następuje degradacja błon oraz białek komórkowych. Po dodaniu soli chaotropowych i etanolu, lizat przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie D N A z w i ą z a n e g o d o z ł o ż a m a n a ce l u u s u n i ę c i e p ozo s t a ł y c h z a n i e c z y s zc ze ń i / l u b i n h i b i t o r ó w r e a kc j i e n z y m a t y c z n y c h. O c z y s zc zo n e D N A e l u o w a n e j e s t ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie e n z y m a m i r e s t r y kc y j n y m i, l i g a c j a D N A i t p.) l u b m o ż e b y ć p r z e c h o w y w a n e do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. 4

5 Nr kat. EM06 VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Wymazy (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny) lub nasienie. WYDAJNOŚĆ IZOLACJI Zależy od rodzaju i ilości pobranego materiału. Do 3 µg DNA dla próbki wymazu oraz 2 7 µg DNA dla 150 µl próbki nasienia. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 25 µg DNA CZAS IZOLACJI minut (łącznie z lizą) CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1,7 1,9 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Próbki wymazów oraz nasienia są materiałami niebezpiecznymi ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z próbkami wymazów/nasienia należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze klasy II bezpieczeństwa biologicznego, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. 5

6 VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości i rodzaju materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie μl Elution Buffer. Ilość oczyszczonego DNA zależy od rodzaju próbki oraz ilości komórek w próbce (jakości wymazu, specyfiki miejsca skąd pobrano materiał oraz zróżnicowania osobniczego). Zwykle wydajność izolacji z 1 próbki wymazu z policzka wynosi 1 3 µg DNA, natomiast z 150 µl nasienia wynosi 2 7 µg DNA. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Maksymalny odzysk DNA można uzyskać poprzez przeprowadzenie dodatkowej elucji (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć punkty Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer zawiera 0,5 mm EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA). Do elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mm Tris-HCl, ph 8,0-9,0 lub innych buforów do celów specjalnych, o ph i stężeniu soli zbliżonych do tego buforu. Zanieczyszczenia RNA Obecność śladowych ilości RNA może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne, ale nie wpływa na inhibicję PCR. Jeśli niezbędne jest otrzymanie oczyszczonego preparatu genomowego DNA wolnego od RNA należy dodać 4 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml; nr kat. RP14, RP145) do próbki p o d o d a n i u S S L B u ff e r ( p k t. 2 P r o t o k o ł u i z o l a c j i ). W y m i e s z a ć i i n k u b o w a ć p r z e z 5 m i n w 3 7 C, a n a s t ę p n i e d o d a ć o d p o w i e d n i ą i l o ś ć P r o t e i n a z y K, a w przypadku izolacji DNA z nasienia dodatkowo 1 M DTT i kontynuować izolację zgodnie z Protokołem izolacji. IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. NASIENIE Próbkę nasienia należy pobrać do jałowego pojemnika. Zestaw pozwala na izolację DNA zarówno z materiału świeżo pobranego, jak i mrożonego. Nasienie można przechowywać w temp. +4 C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej 6

7 Nr kat. EM06 (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy czas. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek przed izolacją. Przed pobraniem odpowiedniej objętości nasienia do izolacji należy dokładnie wymieszać próbkę, z której materiał ma zostać pobrany. Gdy objętość próbki nasienia jest mniejsza niż 150 µl, należy dodać Elution Buffer lub roztworu PBS (brak w zestawie) do całkowitej objętości 150 µl, a następnie przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji z nasienia (sekcja XIA). Należy jednak mieć na uwadze, że wydajność takiej izolacji DNA będzie niższa. B. WYMAZY W celu pobrania wymazu z błon śluzowych jamy ustnej należy co najmniej 10 razy mocno potrzeć jałową pałeczką wymazową wewnętrzną stronę policzka, a następnie końcówkę z pobranymi komórkami nabłonka umieścić w probówce 1,5 2 ml typu Eendorf i odciąć wystający patyczek. Jakakolwiek forma osuszania wymazu nie jest konieczna. Należy upewnić się, że osoba, od której pobierano wymaz nie spożywała pokarmów oraz płynów przez co najmniej 30 minut przed p o b r a ni e m p r ó b k i. U ż y c i e nis k i ej j a ko ś c i m a t e r i a ł u w y j ś c i owe g o z n a c z ą co w p ł y w a na obniżenie wydajności izolacji DNA. Do wykonania wymazu można użyć każdej komercyjnie dostępnej jałowej pałeczki wymazowej. Próbkę wymazu można przechowywać w temp. +4 C przez krótki okres czasu lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy czas. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz DTT w wodzie, zgodnie z zaleceniami na probówkach. 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (bufory SSW1 i SSW2) lub C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 56 C. 5. Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 6. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 7. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 7

8 XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI A. NASIENIE 1. Do 1,5 2 ml probówki typu Eendorf pobrać 150 µl nasienia. Sposób pobierania próbki opisano w sekcji IXA. Przygotowanie próbki. 2. Dodać 350 µl buforu do lizy SSL Buffer, 6 µl Proteinase K oraz 20 µl 1M DTT, worteksować 3 s. 3. Przejść do pkt. 3 Protokołu izolacji DNA z wymazów (sekcja XIB). B. WYMAZY 1. Końcówkę pałeczki wymazowej z pobranym materiałem biologicznym umieścić w 1,5 ml probówce typu Eendorf, a następnie odciąć wystającą część pałeczki tak, aby możliwe było swobodne zamknięcie probówki. Sposób pobierania wymazu opisano w sekcji IXB. Przygotowanie próbki. 2. Dodać 350 µl buforu do lizy SSL Buffer oraz 6 µl Proteinase K, worteksować 3 s. 3. Inkubować przez 30 min w temp. 56 C. Podczas inkubacji kilka razy mieszać próbkę poprzez odwracanie probówki. 4. Dodać 350 µl buforu wiążącego SSB Buffer i worteksować 3 s. 5. Inkubować przez 6 min w temp. 70 C. 6. Dokładnie wycisnąć o ściankę probówki końcówkę pałeczki wymazowej tak, aby odzyskać jak największą ilość lizatu. Odrzucić pałeczkę wymazową. Można nie usuwać pałeczki wymazowej z probówki, jednakże wpłynie to na obniżenie wydajności izolacji DNA ze względu na niecałkowite naniesienie lizatu na minikolumnę. 7. Dodać 200 µl % etanolu (brak w zestawie), wymieszać poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. 8

9 Nr kat. EM06 8. Przenieść 700 µl lizatu na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej. 9. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 10. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 11. Nanieść całą pozostałą objętość lizatu na złoże minikolumny. 12. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 13. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 14. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego SSW1 Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 15. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 16. Dodać do minikolumny 400 μl buforu płuczącego SSW2 Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 17. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 18. Wirować 1-2 min przy tys. rpm (15 21 tys. x g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 19. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 20. Nanieść μl Elution Buffer u p r z e d n i o o d g r z a n e g o do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 21. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 22. M i n i k o l u m n ę u s u n ą ć, a w y i z o l o w a n e D N A p r z e c h o w y w a ć w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 9

10 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Złoże minikolumny zapycha się. Niska wydajność izolacji DNA. Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. W próbce wymazu znajdują się resztki pokarmów. Nieprawidłowo wykonany wymaz; wymaz pobrany z miejsca o małej liczbie złuszczających się komórek. Próbka nasienia pobrana od oligospermicznego mężczyzny. Niecałkowita liza komórek. Niecałkowite wysuszenie kolumny z resztek buforu płuczącego. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Pobrany wymaz jest bardzo niskiej czystości. Niecałkowita degradacja białek w związku z obniżoną aktywnością proteinazy K. Pominięto jeden z dwóch etapów płukania. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Należy powtórzyć izolację, zwracając szczególną uwagę, aby osoba, od której zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej nie spożywała pokarmów przez co najmniej 30 min (patrz sekcja IXB. Przygotowanie próbki). Podczas pobierania materiału upewnić się, że pałeczka wymazowa mocno trze o nabłonek (patrz sekcja IXB. Przygotowanie próbki). Do izolacji DNA z nasienia użyć większą objętość ejakulatu, zwiększając proporcjonalnie objętości poszczególnych roztworów (SSL Buffer, Proteinase K, DTT, SSB Buffer) oraz etanolu. Lizat nanosić na to samo złoże minikolumny partiami po 700 µl. Po każdorazowym naniesniu lizatu, kolumnę należy wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g) i odrzucić supernatant. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 56 C, mieszając próbkę poprzez odwracanie probówki. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer (powyżej 10 minut). Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. Podczas drugiego etapu płukania (pkt. 16 Protokołu izolacji) nanieść 600 µl SSW2 Buffer, wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g), a następnie przeprowadzić etap wirowania suchej kolumny. Upewnić się, że osoba, od której zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej nie spożywała pokarmów i płynów przez co najmniej 30 min. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. -20 C. Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu etapach płukania. Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. 10

11 Nr kat. EM06 Wyizolowane DNA jest podegradowane. Obecność RNA w wyizolowanym DNA. Niewłaściwe przechowywanie materiału. Kolumna związała zarówno DNA, jak i RNA. Zalecane jest przechowywanie wymazów i próbek nasienia w temp. -80 C. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek. Jeśli obecność RNA przeszkadza w dalszych aplikacjach przeprowadzić trawienie RNA przy użyciu RNazy A (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM SSL, SSB BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, P280, P313, P302+P352, P305+P351+P338 PROTEINASE K Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311, P302+P352 DTT Uwaga H302, H315, H319, H335, P261, P280, P305+P351+P338, P302+P352 SSW1, SSW2 BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P233, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem. 11

12