Sherlock AX. 25 izolacji, 100 izolacji

Transkrypt

1 Sherlock AX Zestaw do izolacji genomowego DNA z materiałów o jego śladowej zawartości (plamy krwi, nasienia i śliny, włosy i sierść, tkanki zakonserwowane w parafinie i formalinie, tkanki świeże, krew świeża i mrożona). Procedura z precypitacją DNA. wersja izolacji, 100 izolacji Nr kat , Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 10 µg. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP tel.: , fax: info@aabiot.com 1

2 Skład zestawu Składnik 25 izolacji 100 izolacji Temp. Przechowywania Kolumny oczyszczające Spin 10 AX (niebieskie kółko) Kolumny filtracyjne Filtr 1 (żółte kółko) 25 szt. 100 szt. +4 do +8 ºC 25 szt. 100 szt. Temp. Pok. Probówki 2 ml 25 szt. 100 szt. Temp. Pok. L1.4 roztwór lizujący 9 ml 36 ml Temp. Pok. K2 roztwór płuczący 40 ml 160 ml Temp. Pok. K3 roztwór elucyjny 23 ml 92 ml Temp. Pok. Wzmacniacz precypitacji 300 μl 1,2 ml Temp. Pok. TE bufor 1,5 ml 5 ml Temp. Pok. Proteinaza K 600 μl 2 x 1,1 ml +4 do +8 ºC Izopropanol 20 ml 80 ml Temp. Pok. Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji DNA 2. Woda DEPC (nr kat , ) 3. DTT (dithiothreitol) niezbędny przy izolacji DNA z nasienia, włosów, sierści (nr kat , ) 4. 70% etanol 5. 96% etanol (dla tkanek utrwalonych w parafinie) 6. Heksan / ksylen (dla tkanek utrwalonych w parafinie) 7. Jałowe probówki o poj. 1,5 ml typu Eppendorf 8. Vortex 9. Mikrowirówka 10. Inkubator lub termoblok 50 C UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zalecamy oczyszczenie powierzchni roboczej używając produktu LabZAP (nr kat ) Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji plazmidowego DNA w wypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP tel.: , fax: info@aabiot.com 2

3 Przygotowanie materiału Plamy krwi, nasienia, próbki śliny 1. Umieścić plamę lub próbkę wraz z podłożem w probówce typu Eppendorf. 2. Dodawać kolejno po: 300 µl wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie, nr kat , ), 300 µl roztworu lizującego L1.4, 20 µl Proteinazy K, w przypadku plam nasienia dodatkowo po 20 µl 1M DTT (nie ma w zestawie, nr kat , ). 3. Całość wymieszać przez worteksowane przez 20 s. 4. Inkubować 60 min w temp. 50 C (worteksować od czasu do czasu). 5. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji DNA. Krew świeża lub mrożona 1. Przenieść 300 µl krwi do probówki typu Eppendorf. Uwaga: w przypadku mniejszej ilości krwi niż 300 µl należy dodać jałowej wody do całkowitej objętości 300 µl. 2. Dodawać kolejno po: 300 µl roztworu lizującego L1.4 oraz 20 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez worteksowane przez 20 s. 4. Inkubować 10 min w temp. 50 C (worteksować od czasu do czasu). 5. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji DNA. Tkanki świeże 1. Pociąć ok mg tkanki na małe fragmenty lub rozetrzeć w ciekłym azocie i przenieść do probówki typu Eppendorf. 2. Dodawać kolejno po: 300 µl wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie, nr kat , ), 300 µl roztworu lizującego L 1.4, 20 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez worteksowane przez 20 s. 4. Inkubować min w temp. 50 C (worteksować od czasu do czasu). 5. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji DNA. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP tel.: , fax: info@aabiot.com 3

4 Tkanki utrwalone w parafinie zalecamy użycie zestawu Genomic Micro FFPE (nr kat ) 1. Przenieść tkankę w bloczku parafinowym do probówki typu Eppendorf 2. Dodać odpowiednią objętość ksylenu lub heksanu (nie ma w zestawie), aby tkanka była w nim całkowicie zanurzona. Całość wymieszać przez odwracanie probówki i poczekać do momentu rozpuszczenia parafiny. Zwirować próbkę przez 20 s przy RPM i usunąć supernatant. Proces kilkakrotnie powtórzyć. 3. Usunąć resztki ksylenu/heksanu przez dwukrotne przepłukanie 96% etanolem. Usunąć resztki etanolu przez pozostawienie próbki na 2-5 min w temp. pokojowej. 4. Przejść do punktu 2. protokołu przygotowania materiału - tkanki świeże. Tkanki zanurzone w formalinie 1. Przenieść tkankę do probówki typu Eppendorf. 2. Dodać odpowiednią objętość wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie, nr kat , ), aby tkanka była w niej całkowicie zanurzona. Całość wymieszać przez odwracanie probówki, zwirować i usunąć supernatant. Proces kilkakrotnie powtórzyć. 3. Przejść do punktu 2. protokołu przygotowania materiału - tkanki świeże. Włosy, sierść 1. Pociąć włosy, sierść na ok. 0,5 cm fragmenty i przenieść do probówki typu Eppendorf. 2. Dodać kolejno po: 300 µl wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie, nr kat , ), 300 µl roztworu lizującego L 1.4, 20 µl Proteinazy K, 20 µl 1M DTT (nie ma w zestawie, nr kat , ). 3. Całość wymieszać przez worteksowane przez 20 s. 4. Inkubować w temp. 50 C aż do całkowitego strawienia tkanki (worteksować od czasu do czasu). 5. Przejść do punktu 1. protokołu izolacji DNA. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP tel.: , fax: info@aabiot.com 4

5 Protokół izolacji 1. Próbki nanieść na kolumny filtracyjne Filtr 1. Kolumna z żółtym kółkiem służy do usuwania większych zanieczyszczeń pochodzących z podłoża lub niezlizowanych fragmentów tkanek. 2. Całość wirować 1 min przy RPM (9000 x g). 3. Usunąć kolumny filtracyjne Filtr 1. Przesącz, w którym znajduje się DNA, nanieść na kolumny oczyszczające Spin 10 AX. Kolumna z niebieskim kółkiem jest właściwą kolumną oczyszczającą. 4. Wirować 1 min przy 8000 RPM (6000 x g). 5. Wylać przesącz i ponownie umieścić kolumny Spin 10 AX w tych samych probówkach. 6. Nanieść na kolumny Spin 10 AX po 600 µl roztworu płuczącego K2. Wirować 1 min przy 8000 RPM (6000 x g). 7. Wylać przesącz i ponownie umieścić kolumny Spin 10 AX w tych samych probówkach. 8. Nanieść na kolumny Spin 10 AX po 600 µl roztworu płuczącego K2. 9. Wirować 1 min przy 8000 RPM (6000 x g). 10. Wylać przesącz i umieścić kolumny Spin 10 AX w nowych 2 ml probówkach typu Eppendorf (w zestawie). A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia tel.: , fax: NIP info@aabiot.com

6 11. Nanieść na kolumny Spin 10 AX po 350 µl roztworu elucyjnego K3. Inkubować przez 2 min w temp. pokojowej. 12. Wirować 1 min przy 8000 RPM (6000 x g). 13. Ponownie nanieść na kolumny Spin 10 AX po 350 µl roztworu elucyjnego K3. Inkubować przez 1 min w temp. pokojowej. Wirować 1 min przy 8000 RPM (6000 x g). 14. Usunąć kolumny Spin 10 AX, a przesącz, w którym znajduje się DNA, przenieść pipetą (~ 700 µl) do nowych 1,5 ml probówek typu Eppendorf (nie ma w zestawie). Dodać po 5 µl wzmacniacza precypitacji oraz 600 µl izopropanolu. 15. Całość wymieszać i wirować 10 min przy RPM (9000 x g). 16. Usunąć supernatanty, uważając aby nie usunąć niebieskich osadów DNA. 17. Dodać po 500 µl 70% etanolu. Całość wymieszać i wirować 5 min przy RPM (9000 x g). 18. Usunąć supernatanty, a osady DNA suszyć przez odwrócenie probówek przez 10 min w temp. pokojowej. Jeżeli na ściankach probówki znajdują się resztki alkoholu to należy je osuszyć kawałkiem jałowej waty (doskonale nadają się do tego patyczki higieniczne oraz pałeczki do pobierania wymazów). Niebieska barwa osadu umożliwia śledzenie procesu rozpuszczania DNA. 19. Osady zawiesić w buforze TE (w zestawie), wodzie jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie, nr kat , ) lub buforze Tris 10 mm, ph 8,0 (nie ma zestawie). 20. Oczyszczone DNA przechowywać w temp. 4 C do czasu dalszych analiz. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia tel.: , fax: NIP info@aabiot.com

7 Specyfikacja Złoże Maksymalna objętość próbki membrana jonowymienna krew µl hodowle tkankowe Pojemność kolumny 20 µg hodowle bakteryjne tkanka - 20 mg Operacje Bufor elucyjny wirowanie, próżnia wysokie stężenie soli, precypitacja with linear polyacrylamide carrier Minimalna objętość elucji 100 µl Zalety wydajność izolacji 95% DNA wysoka czystość wyizolowanego DNA Doskoły do prób kryminalistycznych Aplikacje PCR, Real-Time PCR, southern blotting, klonowanie, Elementy do zamówień dodatkowych Składnik Ilość Nr kat. Proteinaza K roztwór (20 mg/ml) 1,1 ml mg L Proteinaza K liofilizat 100 mg L 250 mg L 1000 mg L DTT (dithiothreitol) 5 g g A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP tel.: , fax: info@aabiot.com 7

8 Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Proteinaza K H315 Działa drażniąco na skórę. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. UWAGA L1.4 roztwór lizujący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. NIEBEZPIECZEŃSTWO K2 roztwór płuczący H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO K3 roztwór elucyjny H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO Izopropanol H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, Gdynia NIP tel.: , fax: info@aabiot.com 8