Ćwiczenie 1. Zastosowanie średniociśnieniowej chromatografii cieczowej do izolacji i charakterystyki biomakromolekuł W nowoczesnej biochemii rosnące znaczenie, szczególnie dla celów analitycznych, lecz także w coraz większym stopniu dla celów preparatywnych zyskują metody wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej. Należą do nich: średniociśnieniowa chromatografia cieczowa MPLC (ang. medium pressure liquid chromatography), gdzie stosowane nadciśnienia mieszczą się w zakresie 0.6 5 MPa oraz wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa HPLC (ang. high pressure liquid chromatography), z nadciśnieniami powyżej 5 MPa. Techniki te charakteryzują się wysoką rozdzielczością i krótkim czasem separacji. Sprzęt stosowany do nich jest jednak dość drogi, kosztowne są także specjalne złoża chromatograficzne. Poszczególne elementy zestawu muszą sprostać zwiększonym wymaganiom. Pompy powinny wytwarzać stałe, wolne od pulsacji nadciśnienie, przy zwiększonym ciśnieniu zwrotnym. Kolumny i złoża muszą być odporne na wyższe ciśnienia wytwarzane w zestawie. Detektory charakteryzować się powinny krótkim czasem odpowiedzi na sygnał. Metody średniociśnieniowe znalazły szczególne zastosowanie w separacji białek. Firma Pharmacia Biotech wprowadziła na rynek zestawy FPLC (ang. fast protein liquid chromatography), które obecnie stanowią już standardowe wyposażenie coraz większej liczby laboratoriów. W zestawie tym nadciśnienie wytwarzane jest przez precyzyjne pompy tłokowe skonstruowane ze szkła borokrzemianowego, tytanu i teflonu. Użycie tych materiałów minimalizuje możliwość denaturacji białek, a z drugiej strony umożliwia stosowanie buforów zawierających wysokie stężenia jonów chlorkowych niezbędnych dla chromatografii jonowymiennej. Dla celów FPLC opracowane zostały specjalne złoża chromatograficzne, m.in: Mono Q, Mono P, Resource Q,. Resource P dla chromatografii jonowymiennej, Superdex 200 dla filtracji żelowej, Phenyl Superose dla chromatografii hydrofobowej. Złoża te, utworzone z doskonale sferycznych mikrogranulek, zapewniają duże natężenia przepływu przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. W skład podstawowego zestawu FPLC wchodzą oprócz dwóch pomp detektor UV, rejestrator, kolektor frakcji i moduł sterujący. Ten ostatni element mózg układu umożliwia zaprogramowanie profilu elucji kolumny, w tym kształtu gradientu czynnika elucyjnego, i zapewnia ciągłą kontrolę parametrów podczas procesu chromatograficznego. Bardziej zaawansowane wersje systemu FPLC, sterowane komputerowo, dają możliwość realizacji złożonych procesów chromatograficznych, obejmujących kilka kolejnych etapów. 1.1. Chromatografia kolumnowa białek- podstawy teoretyczne Chromatografia kolumnowa polega na rozdzieleniu mieszaniny poprzez wprowadzenie jej na stacjonarną fazę stałą (adsorbent) umieszczoną w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej na składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej. Przepływ fazy ruchomej może być grawitacyjny lub wymuszony przez niewielkie nadciśnienie wprowadzanego eluentu uzyskiwane np. za pomocą pompy perystaltycznej lub sprężonego gazu. Składniki mieszaniny przemieszczają się ku dołowi z szybkością zależną od siły oddziaływań ich cząsteczek z adsorbentem. Siła tych oddziaływań zależy od budowy cząsteczek, dlatego poszczególne składniki mieszaniny przemieszczają się z różną szybkością. Dzięki temu rozdzielone składniki można kolejno odbierać na dole kolumny. W zależności od wielkości kolumn i ilości rozdzielanego materiału chromatografia kolumnowa może być wykonywana w skali analitycznej, laboratoryjnej (półpreparatywnej, preparatywnej) i przemysłowej.
1.2. Aparatura W zestawie FPLC nadciśnienie wytwarzane jest przez precyzyjne pompy tłokowe skonstruowane ze szkła borokrzemianowego, tytanu i teflonu. Użycie tych materiałów minimalizuje możliwość denaturacji białek, a z drugiej strony umożliwia stosowanie buforów zawierających wysokie stężenia jonów chlorkowych niezbędnych dla chromatografii jonowymiennej. Dla celów FPLC opracowane zostały specjalne złoża chromatograficzne, m.in: Mono Q, Mono P, Resource Q,. Resource P dla chromatografii jonowymiennej, Superdex 200 dla filtracji żelowej, Phenyl Superose dla chromatografii hydrofobowej. Złoża te, utworzone z doskonale sferycznych mikrogranulek, zapewniają duże natężenia przepływu przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. W skład podstawowego zestawu FPLC wchodzą oprócz dwóch pomp detektor UV, rejestrator, kolektor frakcji i moduł sterujący (Fot. 1). Ten ostatni element mózg układu umożliwia zaprogramowanie profilu elucji kolumny, w tym kształtu gradientu czynnika elucyjnego, i zapewnia ciągłą kontrolę parametrów podczas procesu chromatograficznego. Bardziej zaawansowane wersje systemu FPLC, sterowane komputerowo, dają możliwość realizacji złożonych procesów chromatograficznych, obejmujących kilka kolejnych etapów. Fot. 1 Zestaw AKTA-FPLC firmy Pharmacia Biotech 1.3. Zastosowanie FPLC w badaniach biologicznych Podstawowym zastosowaniem metod chromatogrficznych jest oczyszczanie makrocząsteczek biologicznych. Najprostszy schemat strategii oczyszczania obejmuje etapy: 1) ekstrakcji makromolekuł ze źródeł biologicznych, 2) stabilizacji i koncentracji 3) wstępnego podczyszczenia preparatu oraz 4) uzyskania preparatu o wysokiej czystości. Metody chromatograficzne wykorzystuje się w dwóch końcowych etapach. Metodą chromatograficzną najczęściej stosowaną we wstępnych etapach oczyszczania makromolekuł jest chromatografia jonowymienna (ang. ion exchange chromatography IEX). Złoża IEX wykazują wysoką zdolność wiązania i są odporne na trudne warunki oczyszczania związane z nanoszeniem na kolumny surowej mieszaniny makromolekuł. Białka są wymywane z kolumny IEX w gradiencie soli lub poprzez zmianę ph buforu elucyjnego. Typowy chromatogram elucji mieszaniny białek przedstawia Rys1.
Rys. 1 Klasyczny schemat elucji gradientowej IEX Zaletą metody IEX jest możliwość nanoszenia na kolumnę dużych objętości próbki, o wysokim stężeniu białka oraz uzyskanie wstępnie podczyszczonych preparatów w krótkim czasie, przy niewielkim wykorzystaniu buforów elucyjnych. Przykładem kolumny jonowymiennej jest anionit RESOURCE Q (firmy GE HealthCare Life Sciences). Rys. 2 przedstawia przykładowy chromatogram procesu oczyszczania pankreatyny ma kolumnie Resorce Q 1ml w gradiencie NaCl. Rys.2 Chromatogram oczyszczania pankreatyny na kolumnie Resource Q 1ml Rekomendowany przepływ buforu elucyjnego: 1-10 ml/min; maksymalne ciśnienie robocze 1.5MPa; objętość martwa kolumny 1ml Kolejną często stosowaną techniką chromatograficzną jest chromatografia wykorzystująca oddziaływania hydrofobowe makrocząsteczek ze złożem (ang. hydrophobic interaction chromatography HIC). Separacja opiera się na odwracalnej interakcji między białkiem i hydrofobową powierzchnią złoża. Oddziaływanie to jest wzmacniane przez zastosowanie buforów o wysokiej sile jonowej. Metoda stanowi najczęściej kolejny krok stosowany w
procedurze oczyszczania białek po etapie frakcjonowanego wytrącania siarczanem amonu lub wymywania prób przy wysokich stężeniach soli metodą IEX. W celu zwiększenia wydajności wiązania białka ze złożem zawierających nawet 1.5M (NH 4 ) 2 SO 4 lub 4M NaCl. Białka związane wymywane są z kolumny w gradiencie zmniejszającego się stężenia soli np.: (NH 4 ) 2 SO 4.(Rys.3). Inną metodą elucji jest zmiana polarności eluentu poprzez zastosowanie gradientu glikolu etylenowego do 50%, dodatek soli chaotropowych (mocznik, chlorowodorek guanidyny), detergentów lub poprzez zmianę ph buforów. Rys. 3 Klasyczny schemat elucji gradientowej HIC Wyjątkową metodą z punktu widzenia specyficzności oddziaływania makromolekuła: złoże jest chromatografia powinowactwa (ang. affinity chromatography AC). Podstawą separacji w tej metodzie są specyficzne oddziaływania biologiczne. Funkcja biologiczna spełniana w komórkach przez większość makrocząsteczek biologicznych, takich jak: przeciwciała, białka transportowe, białka receptorowe, enzymy, kwasy nukleinowe, jest rezultatem oddziaływania ze specyficznymi cząsteczkami - ligandami. Połączenie makrocząsteczki z ligandem i utworzenie kompleksu makrocząsteczka: ligand powoduje odpowiedź biologiczną. Odpowiedzią taką może być: działanie immunologiczne, kontrola procesów metabolicznych, działanie hormonów, katalityczne przekształcenie substratu, transport przez błony biologiczne. Uzyskanie odpowiedzi biologicznej zależy od właściwego rozpoznania i wiązania ligandu. Do przeprowadzenia chromatografii powinowactwa niezbędne jest otrzymanie złoża w postaci nierozpuszczalnej fazy stacjonarnej, do której przyłącza się trwałymi wiązaniami chemicznymi cząsteczki odpowiedniego liganda. Mieszanina nanoszona na złoże może zawierać wiele typów makrocząsteczek, ale tylko takie, które rozpoznają specyficzny ligand i wiążą się z nim są zatrzymywane w swym ruchu wzdłuż kolumny. Po wymyciu makrocząsteczek niezwiązanych ze złożem i przemyciu kolumny buforem, pożądane makrocząsteczki wymywa się poprzez łagodne rozbicie kompleksu makromolekuła: ligand. Elucji dokonuje się poprzez zastosowanie czynnika elucyjnego, który wiąże się z ligandem na złożu lub niespecyficznie poprzez zmianę ph, siły jonowej lub polarności buforów. Podstawowe etapy oczyszczanie z zastosowaniem AC przedstawia Rys. 4.
Rys. 4 Typowy profil separacji w AC Dzięki wykorzystaniu metod AC możliwe jest oczyszczanie białek fuzyjnych, skonstruowanych tak, aby posiadały w swojej strukturze dodatkowy fragment domenę, oddziałującą ze złożem. Białka fuzyjne zawierające domenę oligohistydynową, obejmującą sześć kolejno po sobie występujących reszt histydynowych, oczyszczane mogą być przy wykorzystaniu chromatografii metalopowinowactwa. Związane ze złożem jony Ni 2+ (lub innych metali grup przejściowych) kompleksują grupy imidazolowe His. Przykładem złoża wykorzystywanego do oczyszczania białek, zawierających ogon oligohis jest IDA-agaroza (His-Bind Resin, Novagen). Jest to złoże posiadające jako grupy aktywne reszty kwasu iminodioctowego (Rys. 5). Grupa ta stosunkowo słabo chelatuje jony metali, ponieważ posiada tylko trzy ligandy zdolne do kompleksowania. Chelatowany jon metalu w geometrii oktaedrycznej posiada aż trzy wolne miejsca koordynacyjne, które potencjalnie mogą służyć do wiązania oczyszczanego białka. IDA jest grupą wywierającą niewielki efekt steryczny na pozostałe wolne miejsca koordynacyjne jonu metalu w efekcie obniża to selektywność wiązania oczyszczanych białek. Rys. 5 Schemat złoża IDA. X - wolne miejsca koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z resztami białka; Me chelatowany przez złoże jon metalu, np. Ni 2+ Białka niezwiązane lub słabo związane wymywane są ze złoża przy pomocy buforów zawierających niskie stężenia imidazolu. Elucji pożądanego białka dokonuje się w gradiencie wzrastającego stężenia imidazolu, który charakteryzuje się większym powinowactwem do złoża IDA-agaroza. Technika AC obok możliwości specyficznego oczyszczenia pożądanej makromolekuły umożliwia również szybkie usunięcie proteaz serynowych z ekstraktów bezkomórkowych i stanowi atrakcyjną alternatywę dla zastosowania specyficznych inhibitorów tych enzymów. Dla specyficznego wiązania m. in. trypsyny, chymotrypsyny oraz ich zymogenów
wykorzystuje się złoża ze związanym specyficznym inhibitorem proteaz: p- aminobenzamidyną (Rys. 6). Rys. 6 Schemat struktury Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (firmy GE HealthCare Life Sciences ) Elucji białek dokonuje się poprzez obniżenie ph buforu, zastosowanie kompetytywnego eluenta: p-aminobenzamidyny lub buforu zawierającego czynniki denaturujące np.: 8 M mocznik czy 6 M chlorowodorek guanidyny. Dotychczas omawiane metody chromatograficzne umożliwiały rozdzielanie substancji na podstawie różnic w polarności, ładunku lub specyficznych oddziaływań z ligandem. Metoda filtracji żelowej lub inaczej chromatografii wykluczania (ang. size exclusion chromatography SEC) wykorzystuje różnice w wielkości cząsteczek. Biocząsteczki posiadają masy cząsteczkowe od około 100 D do kilku megad, tak więc jest zrozumiałe, że metoda umożliwiająca oddzielenie molekuł o masie np. 10 kd od innych o masie 100 kd znalazła szerokie zastosowanie w biochemii eksperymentalnej. Technikę filtracji żelowej wykorzystuje się do celów preparatywnych (oczyszczanie białek, kwasów nukleinowych) i analitycznych (wyznaczanie masy cząsteczkowej, ilościowa analiza oddziaływań międzycząsteczkowych). W filtracji żelowej najpowszechniej używa się czterech typów żeli: dekstranowych, poliakrylamidowych, agarozowych i mieszanych. Historycznie pierwszymi były żele oparte na naturalnym polisacharydzie - dekstranie. Są one produkowane przez firmę firmy GE HealthCare Life Sciences pod handlową nazwą Sephadex.. Poprzez usieciowanie dekstranu N,N -metylenobis-akrylamidem możliwe jest otrzymanie żelu o większym zakresie frakcjonowania. Takie żele są znane pod handlową nazwą Sephacryl. Żele poliakrylamidowe są wytwarzane w wyniku kopolimeryzacji akrylamidu i N,N -metylenobisakrylamidu. Są one produkowane prze firmę BioRad pod nazwą BioGel P. Żele agarozowe charakteryzują się dużymi wartościami granicy wykluczenia. Agaroza, naturalny, obojętny polisacharyd będący składnikiem agaru zbudowany jest z podjednostek galaktozy i anhydrogalaktozy. Struktura żelu jest stabilizowana wiązaniami wodorowymi oraz w wyniku sieciowania epichlorohydryną. Żele agarozowe są produkowane przez firmy GE HealthCare Life Sciences pod nazwą Sepharose i przez firmę BioRad jako BioGel A. Mieszane żele poliakrylamido-agarozowe łączą wysoką rozdzielczość i szeroki zakres frakcjonowania z dużą sztywnością żelu, umożliwiającą osiągnięcie stosunkowo dużych wartości natężenia przepływu. Są one wytwarzane m.in. przez firmę Pharmacia Biotech pod nazwą Superose. Tabela 5 zawiera właściwości niektórych żeli dostępnych handlowo. Żele nowej generacji, np. sferoidalne żele kompozytowe agarozowo-dekstranowe, takie jak Superdex (firmy GE HealthCare Life Sciences ) umożliwiają osiągnięcie dobrej rozdzielczości przy natężeniach przepływu do 1 ml/min. Metodę SEC wykorzystać można do wielu zastosowań. Jednym z nich jest odsalanie oczyszczanego preparatu (Rys. 7). Sole nieorganiczne, rozpuszczalniki organiczne i inne małe cząsteczki są powszechnie używane dla oczyszczania makrocząsteczek biologicznych. Filtracja żelowa jest prostą, tanią i szybką metodą usuwania tych małych cząsteczek z oczyszczanego preparatu - alternatywną wobec dializy.
Rys. 7 Profil elucji próby odsalanej metodą SEC. Innym zastosowaniem SEC jest wymiana buforu. Podczas oczyszczania makrocząsteczek biologicznych często zdarza się, że przejście do następnego etapu wymaga zastąpienia buforu z etapu poprzedniego przez inny. Operacji tej można łatwo dokonać za pomocą filtracji żelowej. Małą kolumnę równoważy się nowym buforem, a następnie przepuszcza przez nią próbkę, dokonując elucji także nowym buforem. Alternatywą dla filtracji żelowej jest w tym przypadku wyczerpująca dializa lub kilkukrotna ultrafiltracja. Najpowszechniejszym zastosowaniem filtracji żelowej jest oczyszczanie makrocząsteczek biologicznych. Dzięki zdolności żeli do frakcjonowania cząsteczek na zasadzie różnic w ich wymiarach, filtracja żelowa stanowi cenne uzupełnienie technik separacyjnych wykorzystujących różnice w polarności i ładunku. Dużą zaletą filtracji żelowej jest jej zachowawczość. Praktycznie nie są znane przypadki denaturacji białek podczas filtracji żelowej. Należy jedynie pamiętać, że jeżeli dla stabilności danego białka jest wymagana obecność jakiegoś związku o małej masie cząsteczkowej, to powinien on stanowić składnik buforu elucyjnego. Metodę SEC wykorzystuje się również do określania masy cząsteczkowej makrocząsteczek biologicznych. Objętość elucji danej substancji w filtracji żelowej jest proporcjonalna do wymiarów geometrycznych cząsteczek tej substancji (Rys. 8). Rys. 8 Zależność objętości elucji od masy cząsteczkowej makromolekuł.
Filtracja żelowa jest więc powszechnie wykorzystywana dla wyznaczania masy cząsteczkowej przede wszystkim białek i, w mniejszym stopniu, kwasów nukleinowych. Za pomocą zestawu białek wzorcowych, o znanych masach cząsteczkowych dokonuje się kalibracji kolumny żelowej. Następnie roztwór zawierający białko o nieznanej masie cząsteczkowej poddaje się procesowi chromatograficznemu na wykalibrowanej kolumnie w warunkach identycznych do tych, które stosowano podczas kalibracji i mierzy objętość elucji. Masę cząsteczkową badanego białka można wówczas odczytać wprost z krzywej wzorcowej. Metoda ta jest prosta w wykonaniu, tania, szybka i wystarczająco dokładna. Można jej używać także do próbek zanieczyszczonych, nawet w obecności innych białek, pod warunkiem, że dysponujemy metodą selektywnej detekcji badanego białka, np. poprzez pomiar specyficznej aktywności enzymatycznej. Oczywiście metoda posiada także pewne ograniczenia. Należy bardzo ostrożnie dobrać odpowiedni żel, tak aby masa cząsteczkowa badanego białka mieściła się w liniowym zakresie krzywej wzorcowej, pożądana jest zatem możliwość zgrubnego oszacowania tej wartości. W teorii filtracji żelowej zakłada się, że wpływ na proces elucji mają tylko efekty steryczne i podziałowe. Jeżeli białko oddziałuje z żelem w sposób adsorpcyjny lub jonowy, to oddziaływania takie powodują opóźnienie elucji i zaniżenie eksperymentalnie wyznaczonej masy cząsteczkowej. Zakłada się także, że cząsteczki białek mają kształt sferyczny, co nie zawsze jest zgodne z prawdą. Zasada rozdziału substancji metodą SEC oparta jest więc na wykorzystaniu porowatości wypełnienia kolumny. Wypełnienia te przygotowuje się z materiałów nieorganicznych lub organicznych wyprodukowanych w ten sposób, że podczas procesu technologicznego w materiale tworzą się liczne mikroskopijne kanaliki lub pory o kontrolowanej wielkości.. Gdy gęsta zawiesina takiego złoża w buforze tworzy wypełnienie kolumny, całkowitą objętość utworzonego wypełnienia można wyrazić wzorem: gdzie: V t = V 0 + V m + V i, V 0 - objętość cieczy poza złożem ( tzw. objętość martwa) V m - objętość samego żelu V i - objętość cieczy zawartej w porach żelu Cząsteczki substancji znajdujących się w roztworze naniesionym na kolumnę ulegają podziałowi pomiędzy fazy V 0 i V i ze specyficznym dla każdej substancji współczynnikiem podziału K d, zależnym od wielkości cząsteczek substancji rozpuszczonej. Małe cząsteczki wnikają do porów i są w ten sposób relatywnie zatrzymywane w stosunku do molekuł dużych, które przechodzą swobodnie pomiędzy ziarnami złoża. Uwzględniając współczynnik K d można zapisać: V e = V 0 + K d x V i, lub K d = (V e - V 0 )/V i, gdzie V e jest objętością elucji substancji. Gdy zdefiniujemy retencję R jako V 0 /V e, to: R = V 0 /(V 0 + K d x V i ) Prawie wszystkie objętości ujęte w powyższych równaniach mogą być zmierzone eksperymentalnie. V 0 wyznacza się przepuszczając przez kolumnę substancję o masie cząsteczkowej tak dużej, że nie wnika w ogóle do porów i kanalików żelu. W tym celu
najpowszechniej stosuje się tzw. Blue Dextran - polisacharyd, do którego kowalencyjnie przyłączono molekuły barwnika Cibaron Blue. Blue Dextran ma masę cząsteczkową około 2 x 10 6 D. V i można wyznaczyć przepuszczając przez kolumnę substancję barwną o bardzo małej masie cząsteczkowej, V t natomiast oblicza się bezpośrednio z wymiarów geometrycznych kolumny. Pozostającą objętość V m często pomija się jako dużo mniejszą od pozostałych. W filtracji żelowej istnieje bezpośrednia zależność pomiędzy objętością elucji a wymiarami geometrycznymi cząsteczek substancji chromatografowanej. Dla większości substancji wymiar geometryczny jest z kolei skorelowany z masą cząsteczkową. Empiryczny opis tej korelacji jest dany równaniem: V e = A + B log MW s, gdzie A i B są stałymi charakterystycznymi dla danej kolumny upakowanej określonym złożem. Wykreślając V e w funkcji log MW s otrzymuje się najczęściej wykres liniowy, przynajmniej w pewnym zakresie mas cząsteczkowych, charakterystycznym dla danego rodzaju żelu. Równanie stanowi dla eksperymentatora stosunkowo godną zaufania podstawę dla wyznaczania mas cząsteczkowych, pod warunkiem, że dostępne są substancje wzorcowe - markery - o znanych MW s dla wykalibrowania kolumny. Tylko w ten sposób można wyznaczyć parametry A i B. 1.4. Eksperymenty Eksperyment 1. Oczyszczanie białka fuzyjnego z domeną His-tag z wykorzystaniem minikolumny HisTrapFF Minikolumna HisTrapFF pozwala na oczyszczanie białka fuzyjnego, zawierającego domenę oligohistydynową, obejmującą sześć kolejno po sobie występujących reszt histydynowych. Związane ze złożem jony Ni 2+ są kompleksowane przez reszty imidazolowe reszt His co skutkuje związaniem białka fuzyjnego ze złożem. Ekstrakt bezkomórkowy, powstały w wyniku sonifikacji komórek nadprodukujących białko fuzyjne i odwirowaniu fragmentów stałych jest w eksperymencie nanoszony na złoże kolumny HisTrapFF. W kolejnym etapie następuje wymycie białek niezwiązanych oraz elucja właściwego białka w gradiencie imidazolu. Materiały 1. Ekstrakt bezkomórkowy (EB) 2. Bufor do nanoszenia zawierający 5 mm imidazolu 3. Bufor elucyjny zawierający 500mM imodazol 4. Minikolumna HisTrapFF 5. Zestaw AKTA FPLC 6. Kolektor frakcji Wykonanie eksperymentu 1. Zrównoważyć kolumnę buforem do nanoszenia (dwie objętości kolumny) 2. Nanieść 2 ml EB 3. Wymyć białka niezwiązane buforem do nanoszenia (dwie objętości kolumny)
4. Dokonać elucji białka związanego z wypełnieniem kolumny przy pomicy rozdziału buforu elucyjnego. 5. Na podstawie obrazu chromatogramu zebrać i oznaczyć właściwe frakcje. 6. Dokonać pomiaru stężenia białka w ekstrakcie bezkomórkowym oraz w zebranej frakcji, wyznaczyć całkowitą ilość białka w obu frakcjach i określić procentową zawartość białka fuzyjnego w EB. Eksperyment 2. Wyznaczenie masy cząsteczkowej białka metodą filtracji żelowej Kolumna Superdex TM 200 pozwala na oszacowanie mas cząsteczkowych białek w zakresie 10-600 kda. W celu dokonania rozdziału, zagęszczony preparat białka, uzyskany w procesie oczyszczania jest w eksperymencie nanoszony na kolumnę Superdex 200. Stężenie nanoszonego białka powinno mieścić się w zakresie 1-2 mg/ml. Przed naniesieniem próby na aparaturę, kolumnę równoważy się wcześniej przygotowanym 20mM buforem fosforanowym o ph=7 z dodatkiem 0.15M NaCl. Materiały Uwaga: wszystkie bufory muszą być odgazowane przed użyciem. Można to zrobić poprzez wygotowanie lub przy użyciu pompy próżniowej. 1. Kolumna Superdex TM 200 2. Bufor elucyjny: 20mM bufor fosforanowy 0.15M NaCl ph 7.0 3. Próbka nieznanego białka o stężeniu 1-2mg/ml w buforze elucyjnym 4. System AKTA FPLC z detektorem UV280 oraz kolektorem frakcji 5. probówki szklane 6. kolorymetr (np. Spekol 11) 7. odczynniki do oznaczania stężenia białka Wykonanie eksperymentu 1. Zrównoważyć kolumnę buforem elucyjnym (dwie objętości kolumny). 2. Nanieść 0.5 ml zagęszczonej próby białka. 3. Wymyć białko buforem elucyjnym przy prędkości 0.5ml/min. 4. Na podstawie obrazu chromatogramu zebrać i oznaczyć właściwe frakcje. 5. Wykorzystując poniższe dane sporządzić wykres V e jako funkcji log MW s dla podanych białek 6. Na podstawie uzyskanej wartości V e badanego białka i dostępnych danych wyznaczyć jego masę cząsteczkową. 7. Porównać wyznaczone eksperymentalnie masy cząsteczkowe z danymi literaturowymi podanymi przez prowadzącego ćwiczenie dla nieznanego białka. Podać przyczyny ewentualnego błędu oznaczenia. M [kda] V e [ml] Cytochrom C 12.4 17.48 Anhydraza węglanowa 29 16.48 BSA 66 14.02 Dehydrogenaza alkoholowa 150 13.14 β-amylaza 200 12.1 Objętości elucji i masy cząsteczkowe białek wzorcowych