Zakres zastosowań chromatografii wykluczania

Transkrypt

1 Zakres zastosowań chromatografii wykluczania CHROMATOGRAFIA WYKLUCZANIA (dawniej żelowa PC/SEC) prof. M. Kamiński WCh-PG Gdańsk, Badanie rozkładu masy molekularnej różnego typu materiałów polimerów i biopolimerów - Otrzymywanie frakcji polimerów o mało zróżnicowanej lub jednakowej wielkości masy molekularnej (nisko-dysperyjnych) i frakcjonowania (najczęściej rozdzielanie wstępne) materiałów w badaniach biochemicznych, mikrobiologicznych oraz w biotechnologii, biologii molekularnej, medycynie - Oznaczanie składników próbki, różniących się znacznie masą molekularną (wielkością cząsteczek / cząstek), np. oznaczanie zawartości pektyn, antyutleniacza w olejach i smarach, wiskozatora, składu grupowego środków myjących itp., - Przygotowanie próbki / wsadu do badań / rozdzielania w innych warunkach (zwłaszcza wyodrębnianie frakcji nisko-molekularnej z materiału o wyższej masie cząsteczkowej, np.. WWA, pestycydów, niektórych witamin,... z tłuszczów, osadów itp.) -Odsalanie białek 1

2 Gel Permeation: 1958 Chromatografia wykluczania (żelowa) GPC/SEC mechanizm rozdzielania Wykluczanie Technika rozdzielania pod względem wielkości cząsteczek / cząstek w warunkach eliminacji, albo co najmniej - minimalizacji sorpcji. O rozdzielaniu powinna decydować tylko różnica czasu dyfuzji molekuł / cząstek koloidalnych w przestrzeni porów wypełnienia kolumny. Idea niemożliwa do realizacji z zastosowaniem TLC wymaga długiej kolumny. Częściowe wykluczanie Brak wykluczania Technika wykorzystywana dla substancji lipofilowych, (THF, CH2Cl2, ) albo hydrofilowych (bufory z dodatkiem EDTA, ). Nie wolno skokowo zmienić polarności!!! 2

3 Dzięki regulacji rozmiarów porów, które działają niczym sito, ale odwrotne, możliwe staje się rozdzielenie mieszanin różniących się wielkością cząsteczek / cząstek min 3

4 Układy chromatograficzne typu GPC / SEC W warunkach nie-wodnych Eluenty: THF, dioksan, czerochloroetylen, chlorobenzen, toluen, ksylen, ; Fazy stacjonarne: kopolimer styren-diwinylobenzen; do badań rozkładu masy cząsteczkowej polimerów nisko i średnio polarnych, a także lipidów, fosfolipidów itp.. W warunkach wodnych Eluenty: dimetyloformamid, metanol, acetonitryl i ich mieszaniny z wodą i z wodnymi roztworami soli, kwasów i zasad, roztwory buforowe bez dodatku składników organicznych: Fazy stacjonarne: polidekstrany, policukry, poliwęglany, szkła porowate, silanizowanyżel krzemionkowy, diole związane z pow. nośninka,. Zasady doboru fazy stacjonarnej Rozkład wielkości porów wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny chromatograficznej / w strukturze mikroporowatego wypełnienia monolitycznego kolumny powinien być dostosowany do rozkładu wartości hydrodynamicznych średnic cząsteczek rozdzielanych, a więc do rozkładu masy cząsteczkowej badanej / rozdzielanej mieszaniny. Powinien mieć miejsce brak oddziaływań sorpcyjnych między składnikami rozdzielanej mieszaniny i powierzchnią porów wypełnienia kolumny. Faza stacjonarna musi być odporna na składniki eluentu i na składniki rozdzielanej mieszaniny, nie może się w nich rozpuszczać, ani nadmiernie pęcznieć. Jeżeli ma miejsce pęcznienie ziaren wypełnienia, powinno zostać zakończone przed wypełnieniem kolumny fazą stacjonarną 4

5 Gel Permeation: 1958 Particle size Pore size MW range 5µm 60A* ,000 5µm 100A* ,000 5µm 300A* 17, , min 5

6 WYPELNIENIA TWARDE o kontrolowanym rozkładzie porowatości Najczęściej stosowane są obecnie do chromatografii wykluczania substancji liofilowych usieciowane przestrzennie porowate kopolimery styren di-vinylobenzen vinylobenzen, natomiast do chromatografii wykluczania substancji hydrofilowych porowate sorbenty typu DIOL, najkorzystniej na bazie ZrO2. Kalibracja w zakresie rozkładu masy molekular- nej i postępo- wanie w celu określenia polidyspersyj ności kopolime- ru o bimo- dalnej charakte- rystyce polidyspersyj ności 6

7 Wielkość porów, a zakres rozdzielania Kolumny o różnych zakresach / porowatości średnic / wielkości porów Uwaga -- Wysokie wartości średnic porów - umowne 7

8 Średnica porów [nm] a zakres masy cząsteczkowej rozdzielanych substancji Kolumna ochronna (tzw. prekolumna ) stosowana rzadko w celu nasycania eluentu fazą stacjonarną Termostat Schemat ideowy najprostszego układu aparatu chromatograficznego - HPLC do chromatografii GPC/SEC warunki z reguły izokratyczne, detekcja RID / LLSD 8

9 Wyznaczanie rozkładu masy cząsteczkowej Wyznaczanie rozkładu masy cząsteczkowej Przykładowy chromatogram roztworu kalibracyjnego zawierającego polimery o masach: , , 30300, 2450 Da. Kolumna: LiChrogel PS MIX, eluent: tetrahydrofuran, przepływ: 0,8 ml/min, temperatura: pokojowa. Przykład chromatogramu roztworu polimeru polistyrenowego. 9

10 PCV i plastyfikatory PCV - oznaczanie rozkładu masy molekularnej oraz zawartości plastyfikatorów 10

11 olej BHT Odsalanie H2O Fosfo-gliko-lipidy 11

12 GPC/SEC - białka 12

13 Rozdzielanie białek i peptydów serwatki mleka w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym TSK 3000 SW 10 um Warunki GPC/SEC z dodatkową adsorpcją; Eluent - bufor fosforanowy, dp=10um, Lc=60cm, w=0.5ml/min Rozdzielanie i kalibracja - GPC/SEC białek, kolumny - ZrO2-DIOL 13

14 Rozdzielanie zdysocjowanych protein mleka warunki GPC / SEC dla żelu krzemionkowego jako wypełnienia kolumny i wody jako eluentu 14

15 ZASTOSOWANIE GPC / SEC Oznaczanie rozkładu masy cząsteczkowej polimerów biopolimerów Oznaczanie dodatków uszlachetniających lub zanieczyszczeń polimerów, smarów, olejów, tłuszczów, kosmetyków Do otrzymywania frakcji polimerów / biopolimerów o mało zróżnicowanej lub jednakowej wielkości (niskodysperyjnych) Przygotowanie próbek; do oznaczania niskocząsteczkowych zanieczyszczeń w żywności, produktach naftowych i w środowisku Do frakcjonowania (najczęściej wstępnego) materiałów w badaniach biochemicznych, mikrobiologicznych, biotechnologii Do odsalania po wysoleniu i rozpuszczeniu precypitatu Do wytwarzania parafiny aptecznej Inne 15