HPLC. Badanie czystości chlorowodorku propranololu. chlorowodorku propranololu. Badanie uwalniania. z tabletki

Transkrypt

1 HPLC Badanie czystości chlorowodorku propranololu Badanie uwalniania chlorowodorku propranololu z tabletki mgr farm. Piotr Podsadni

2 FAKULTATYWNY BLOK PROGRAMOWY FARMACJA PRZEMYSŁOWA W ramach ćwiczeń praktycznych każdy student wykonuje samodzielnie operacje przeprowadzane w przemyśle w trakcie opracowania technologii leku syntetycznego od etapu syntezy (API) do otrzymania i kontroli postaci leku. Działania polegają na: - własnoręcznie przeprowadzonej syntezie wybranej substancji leczniczej (API) z pełną kontrolą parametrów fizyko-chemicznych w celu otrzymania substancji o jak najwyższej czystości oraz z jak największą wydajnością. - otrzymania docelowej postaci leku z wykorzystaniem sprzętu udostępnionego Katedrze i Zakładowi Technologii Leków i Biotechnologii Farmaceutycznej do celu ćwiczeń przez zewnętrzny ośrodek badawczy przemysłu farmaceutycznego. - kontroli i porównaniu parametrów otrzymanej postaci leku z preparatem referencyjnym. Przewodnik dydaktyczny.

3 Jak wytworzyć nowy produkt albo nową technologię? (Technologia to też produkt)

4 Proces tworzenia produktu 1.Koncepcja produktu (pomysł), 2.Przegląd literatury, 3.Konsultacje z fachowcami, Czy warto zrealizować pomysł? 4.Rozpoznanie rynku, 5.Finansowanie, administracja i biurokracja, 6.Wybór dostawców i współpracowników, 7.Pierwsze próby w małej skali, 8.Zwiększanie skali stopniowo aż do skali przemysłowej, 9.Budowa linii produkcyjnej lub fabryki, 10.Kontrola i nadzór (PIP, BHP, Sanepid, normy...) 11.Komrecjalizacja, sprzedaż, dystrybucja i marketing, 12.Obsługa posprzedażowa.

5 Co to jest kontrola?

6 Kontrola Kontrola - sprawdzanie czegoś, zestawianie stanu faktycznego ze stanem wymaganym. Zakres czynności sprawdzający zapewnienie jakości. Jakość to stopień, w jakim zbiór właściwości obiektu spełnia wymagania. Księga jakości, polityka jakości, zgodność z normami.

7 Kontrola Na każdym etapie wykonywania procedury, Razem z wykonywaniem procedury, Tuż po wykonaniu procedury lub etapu, Po ustalonym czasie, Ciągła, Wyrywkowa, To nie audyt.

8 Wyniki kontroli Przechowywane z dokumentacją wytwórczą produktu (raport szarżowy), Zgodne ze specyfikacją lub innymi wytycznymi zawartymi w procedurach, Konieczne są do zwolnienia produktu (świadectwo analizy), Przegląd kolejnych wyników z pewnego okresu pozwala na ocenę jakości poszczególnych elementów produkcji.

9 Zapewnienie prawidłowej kontroli Legalizacja, przeglądy i serwis urządzeń, Walidacja procesu, Kalibracja metod, Daty ważności odczynników, Daty ważności szkoleń i kompetencje pracowników, Know-how.

10 Jak ważna jest czystość substancji czynnej?

11 Jak ważna jest czystość? Zanieczyszczenia : Zmniejszają stężenie substancji aktywnej na jednostkę masy rozcieńczanie (ale może też zwiększać stężenie); Zmieniają siłę działania synergia, antagonizm; Powodują niezgodności pomiędzy substancjami; Powodują dodatkowe efekty uboczne; Wpływają na odczucia subiektywne tj.: smak, zapach, kolor; Zmieniają trwałość;

12 Jak można w najprostszy legalny sposób określić czystość?

13

14 Jak można określić czystość? Organoleptycznie kolor, zapach, smak Fizycznie temperatura topnienia, Chemicznie reakcje charakterystyczne, Instrumentalnie chromatografia, IR, NMR, Biologicznie.

15 Metody Badania Substancji Czynej Aby produkt był zaakceptowany przez odbiorcę musi spełniać narzucone warunki, czyli mieć właściwą jakość. Dokumenty wyznaczające jakość są normami np. Farmakopea Polska IX. Działanie zgodnie z normami ułatwia życie.

16 Utrzymanie wysokiej albo właściwej czystości produktu = Zapewnienie jakości produktu

17 Analiza próbek Każda metoda pozwalająca na wyznaczenie stężenia może znaleźć zastosowanie. Trzeba dobrać metodę do celu badania, czyli należy znać możliwości i ograniczenia metody jak i charakterystykę produktu.

18 Procedura lub metoda Dokładna, Powtarzalna, Odtwarzalna, Zrozumiała, Efektywna, Identyfikowalna, Pasować do danego produktu.

19 Opracowanie wyników Specyfikacja dokument zawierający charakterystykę produktu gotowego do zwolnienia oraz minimalne wartości graniczne dla wyników kontroli dla tego produktu. Zawiera też wskazanie właściwych procedur mogą być to normy. Raz na pewien czas. (dot. też procesów i usług) Świadectwo analizy dokument zawierający wyniki właściwych analiz, otrzymanych na podstawie wskazanych w specyfikacji procedur i porównanie z wymaganiami zawartymi w tej specyfikacji. Dla każdej analizy.

20 Chromatografia Chromatography (IUPAC): A physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction.

21 Chromatografia cieczowa LC Cienkowarstwowa - bibułowa - płytkowa Kolumnowa - prosta - flash - HPLC

22 Chromatografia cieczowa LC Parametry chromatograficzne czas retencji - tr czas martwy - tm współczynnik retencji - k sprawność - liczba półek - N Selektywność współczynnik selektywności (rozdzielenia) - α rozdzielczość Rs Współczynnik Rf

23 Czas retencji - tr i czas martwy - tm Czas retencji odległość liczona czasem (minutami) od rozpoczęcia analizy (wstrzyknięcia próbki) do maksimum piku. Czas martwy czas retencji substancji niezatrzymywanej przez układ chromatograficzny.

24 Współczynnik Rf Współczynnik Rf - w chromatografii cienkowarstwowej iloraz odległości przebytej przez substancję rozdzielaną (mierzoną do jej środka) przez odległość przebytą przez czoło eluentu. Zaletą chromatografii cienkowarstwowej jest widoczność całej analizy, nawet gdy są substancje na starcie. Substancji zaabsorbowanych na kolumnach lub o bardzo dużym czasie retencji można nie zauważyć w czasie analizy (piki duchy lub bardzo rozciągnięte piki).

25 Współczynnik retencji - k Współczynnik retencji k jest to stosunek czasu, który analit spędza w fazie stacjonarnej do czasu jaki spędza w fazie ruchomej. t r t m k= tm

26 Sprawność - liczba półek teoretycznych N Sprawność wpływa na wytwarzanie wąskich pików na chromatogramie. 2 ( ) tr N =16 wb lc H= N

27 Selektywność współczynnik selektywności α Współczynnik selektywności α jest miarą selektywności układu w stosunku do dwóch substancji. k 2 t r2 t m α= = k 1 t r1 t m α = 1 brak selektywności i rozdziału

28 Rozdzielczość - Rs Rozdzielczość określa stopień rozdziału pików. Zależy od odległości i szerokości pików. t r2 t r1 R s=2 w b1 w b2 Piki powinny być wysokie i wąskie.

29 Parametry chromatograficzne

30 Budowa chromatografu Pojemniki na fazę ruchomą, Pompy i mieszalnik, Zawór i pętla, Piec, Kolumna, Detektor: UV-Vis, DAD, MS, ELSD, RF, Pojemnik na odpady.

31 Rodzaje faz Fazy stacjonarne: rodzaj podłoża - polimerowe i krzemionkowe, rodzaj modyfikatora - polarne i niepolarne, jonowe i niejonowe, wielkość i kształt ziaren, upakowanie, Fazy ruchome: Rozpuszczalniki tj.: woda, alkohole, acetonitryl, Dodatki do faz - bufory, pary jonowe,

32 Fazy stacjonarne Modyfikowane, porowate, o dużej powierzchni podłoża krzemionkowe lub polimerowe adsorbenty na powierzchni, których zatrzymują się składniki analizy. Adsorpcja następuje przez różne mechanizmy oddziaływań międzycząsteczkowych. Podobne z podobnym. Faza stacjonarna stanowi wypełnienie kolumn.

33 Wymogi dla fazy stacjonarnej Odpowiednie powinowactwo do składników analizy, Bierność chemiczna, Odpowiedni rozmiar kolumny (ilość fazy stacjonarnej i kształt kolumny) w stosunku do ilości rozdzielanych składników, Ekonomiczna, Jak najbardziej uniwersalna.

34 Ograniczenia faz stacjonarnych Czynniki hydrolizujące powiązania podłoża z cząstkami modyfikującymi, Czynniki rozpuszczające składniki fazy stacjonarnej, Czynniki trwale modyfikujące skład fazę stacjonarną, Zbyt duże powinowactwo składników analizy do fazy.

35 Fazy ruchome - eluenty Rozpuszczalniki organiczne i nieorganiczne o dużej rozpiętości polarności, Mieszanki tych rozpuszczalników, Dodatki.

36 Wymagania dla faz ruchomych Nie mogą trwale reagować z składnikami analizy oraz układem chromatograficznym; Ciecze muszą się mieszać; Dodatki do faz muszą się rozpuszczać w fazie; Faza musi rozpuszczać składniki analizy; Faza musi mieć właściwą moc elucyjną wobec WSZYSTKICH składników analizy; Ekonomiczna.

37 Co można rozdzielać? Na polarnych fazach stacjonarnych związki polarne lub jonowe. Wymywanie następuje przez wzrost udziału polarnego rozpuszczalnika w fazie ruchomej. Jest to chromatografia faz normalnych NP. Na niepolarnych fazach stacjonarnych związki niepolarne lub o niskiej polarności. Wymywanie następuje przez wzrost udziału niepolarnego rozpuszczalnika w fazie ruchomej. Jest to chromatografia faz odwróconych RP.

38 Chromatografia cieczowa LC Cienkowarstwowa HPLC Niska Wysoka Szybki Wolny Wysoka Bardzo wysoka Dobra Wysoka Dobra Bardzo dobra Ręczna Automatyczna Powtarzalność Dobra Wysoka Analiza ilościowa Dobra Bardzo dobra Cena Czas analizy Czułość Selektywność Rozdzielczość Kontrola parametrów

39 Fazy stacjonarne Phenomenex Kinetex

40 Propranolol Jaką chromatografię zastosować? Jakie fazy? H O OH H N CH3 CH3

41 Chlorowodorek propranololu Jaką chromatografię zastosować? Jakie fazy? + H O OH NH2 CH3 CH3 Cl

42 Najpopularniejsza i najbardziej uniwersalna jest chromatografia faz odwróconych. Stosuje się kolumny C18, a jako jeden z rozpuszczalników wodę.

43 Faza stacjonarna C18 Faza RP. Żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi.

44 Faza stacjonarna C18 Chlorowodorek propranololu jest słabym kwasem wg Bronsteda-Lawry'ego Propranolol jest sładą zasadą wg Bronsteda-Lawry'ego Podlegają zatem równowadze kwaszasada w roztworach wodnych. Można je opisać stałymi Ka i Kb. W roztworze są dwie formy. Jedna jest zatrzymywana lepiej.

45 Faza stacjonarna C18 Można przeprowadzić chlorowodorek propranololu w zasadę: przed analizą ale mogą być straty. w czasie analizy utrzymując dostatecznie wysokie ph fazy ruchomej (ale za wysokie dla kolumny) Zakwaszenie wytworzy nam sól jony, ale kolumna wytrzyma.

46 Chromatografia par jonowych IPC Zastosowanie dodecylosiarczanu sodu. Teorie: tworzą się micele hydrofobowe albo następuje czasowa modyfikacja fazy stacjonarnej. Związek jonowy ulega retencji na kolumnie.

47 Nie zapominajmy o celu chromatografii ZANIECZYSZCZENIA

48 Zanieczyszczenia Część zanieczyszczeń możemy przewidzieć. Produkty konkurencyjne Substraty Produkty rozpadu Substancje z technologii procesu Nie znamy jednak charakteru wszystkich zanieczyszczeń.

49 Zanieczyszczenia Zatem faza jest przystosowana do rozdzielania jak najszerszego spektrum związków. Woda Acetonitryl Dodecylosiarczan sodu Fosforan tetrabutyloamoniowy Kwas siarkowy Zasada sodowa (do ustalenia ph)

50 Zanieczyszczenia Nie wszystkie substancje można zaobserwować przy użyciu prostego zestawu HPLC z detekcją UV-Vis. Można natomiast wyznaczyć stężenie propranololu porównując pole powierzchni pod pikiem z krzywą wzorcową. Przewaga chromatografii cienkowarstwowej.

51 Zanieczyszczenia Rozpuszczalne w fazie Nierozpuszczalne w fazie Mechaniczne Nierozpuszczone

52 Interpretacja chromatogramu Zanieczyszczeń w próbce powinno być bardzo mało, więc żeby je zobaczyć potrzeba dużej ilości próbki. Pik substancji jest dużo większy niż zanieczyszczenia. Ogólnie jest bardzo duży, ponieważ zależy nam na zanieczyszczeniach, czyli tych bardzo małych pikach. Badamy zależność pola powierzchni pików zanieczyszczeń w stosunku do pola powierzchni pików z chromatogramów wzorcowych.

53 Przeprowadzenie ćwiczenia Wg instrukcji: Przygotowanie roztworu badanego; Przeprowadzenie analizy; Interpretacje chromatogramu; Wyznaczenie zawartości chlorowodorku propranololu w badanej próbce; Wyznaczenie zawartości zanieczyszczeń; Prawidłowe wypełnienie Świadectwa Analizy

54 Przeprowadzenie ćwiczenia Przygotowanie sprzętu (szkło i HPLC) Przygotowanie potrzebnych roztworów Kontrola wstępna substancji czynnej Sporządzenie roztworu substancji czynnej o znanym stężeniu Kontrola roztworu Wykonanie analizy Obliczenia i interpretacja wyniku Prawidłowe wypełnienie Świadectwa Analizy

55 Przeprowadzenie ćwiczenia

56 Przeprowadzenie ćwiczenia

57 Przeprowadzenie ćwiczenia

58 Przeprowadzenie ćwiczenia f(x) = ,98x ,54 R² = Stężenie substancji czynnej (chlorowodorku propranololu) [mg/10ml] 25

59 Badanie uwalniania chlorowodorku propranololu z tabletki

60 Co będziemy badać? Dlaczego jest to tak ważne?

61 Przeprowadzenie ćwiczenia Wg instrukcji: Przygotowanie zestawów do uwalniania; Przygotowanie próbek; Przeprowadzenie procesu uwalniania z poborem próbek; Analiza próbek; Interpretacje chromatogramu; Wyznaczenie zawartości chlorowodorku propranololu w badanej próbce; Wykonanie pozostałych badań; Prawidłowe wypełnienie Świadectwa Analizy

62 Metody Badania tabletek Wygląd Czas rozpadu Jednolitość masy Odporność na ścieranie Odporność na zgniatanie Zawartość substancji leczniczej Uwalnianie substancji leczniczej Czystość zanieczyszczenia, mikrobiologiczna, metale ciężkie

63 Uwalnianie substancji leczniczej rozpuszczalność substancji leczniczej powierzchnię kontaktu substancji leczniczej z otaczającym płynem stopień rozdrobnienia substancji leczniczej struktura krystaliczna substancji leczniczej rodzaj płynu do uwalniania szybkość rozpadu substancje pomocnicze

64 Uwalnianie substancji leczniczej Aparat łopatkowy Aparat koszyczkowy Aparat przepływowy (z zawracaniem lub bez zawracania płynu akceptorowego)

65 Pytania?

66 Egzamin na myślenie. Jedno pytanie z badania substancji czynnej; Trzy podpunkty; Czytać uważnie i ze zrozumieniem; Nadmiar danych; Jedna, konkretna odpowiedź (sprawdzam pierwszą); Jeden konkretny przykład i uzasadnienie tylko do niego; Krótko i zwięźle (maks. 5 zdań).

67 Egzamin wymagania Znajomość procesów i operacji jednostkowych syntezy chlorowodorku propranololu; Metody analizy produktu inne niż HPLC; Parametry chromatografii i wpływ na nie; Zasadę działania chromatografii i zastosowanie; Znajomość zalet i ograniczeń różnych rodzajów chromatografii. Zasady oznaczania czystości chlorowodorku propranololu.

68 Dziękuję za uwagę!