SPECJALNE TECHNIKI ROZDZIELANIA W BIOTECHNOLOGII. Laboratorium nr1 ODSALANIE I ZATĘŻANIE ROZTWORU BIAŁKA W PROCESIE FILTRACJI STYCZNEJ

Transkrypt

1 SPECJALNE TECHNIKI ROZDZIELANIA W BIOTECHNOLOGII Laboratorium nr1 ODSALANIE I ZATĘŻANIE ROZTWORU BIAŁKA W PROCESIE FILTRACJI STYCZNEJ Opracowała: dr inż. Renata Muca, dr inż. Wojciech Marek I. WPROWADZENIE TEORETYCZNE W filtracji stycznej (ang. TFF Tangential Flow Filtration) przepływ strumienia zasilającego odbywa się równolegle do powierzchni membrany. Schemat procesu przedstawiono na rys. 1. Takie rozwiązanie, w porównaniu z przepływem prostopadłym, powoduje mniejsze ryzyko zatykania porów membrany przez filtrowane cząstki. Umożliwia to prowadzenie procesu bez konieczności okresowej zmiany kierunku przepływu, jak również nie powoduje szybkiego wzrostu oporów przepływu. Wadą tego procesu jest stosunkowo niska prędkość przepływu strumienia filtratu. Można ją poprawić przez zwiększenie parcia na membranę, lecz jest to ograniczone wytrzymałością ciśnieniową membrany. Rys.1. Schemat aparatu do filtracji stycznej wraz z kierunkami przepływu poszczególnych strumieni [1]. 3

2 Przepływ filtratu/permeatu Dzięki zastosowaniu przepływu stycznego cząstki osiadające na membranie są porywane przez strumień retentatu i membrana ulega samooczyszczaniu. Ma to wpływ na możliwy czas ciągłej pracy membrany charakteryzowany przez ilość przefiltrowanej cieczy jak na rys. 2, po prawej. Małe nachylenie krzywej na prezentowanym wykresie świadczy o możliwości dłużej pracy membrany. Filtrat/Permeat Zasilanie Retentat Filtrat/Permeat Przetworzona objętość Rys. 2. Po lewej: przekrój przez membranę w czasie przepływu stycznego. Po prawej: spadek przepływu filtratu wywołany zmniejszeniem sprawności membrany w czasie procesu [1]. I.1. Zatężanie próbki W procesie zatężania zwiększamy stężenie głównego składnika próbki. Wykorzystywana przy tym membrana musi posiadać pory odpowiednio mniejsze od rozmiarów składnika kluczowego tak, aby został on zatrzymany w strumieniu retentatu. Cząstki mniejsze od porów membrany np. cząsteczki rozpuszczalnika próbki, przechodzą przez membranę i są obecne w strumieniu filtratu patrz rys. 3. 4

3 Rys.3. Zatężanie próbki w procesie ultrafiltracji [2]. Zatężanie prowadzi się do osiągnięcia żądanych wartości stężenia składnika kluczowego w próbce. Należy przy tym zwrócić uwagę na możliwość wystąpienia krystalizacji w zatężanym roztworze. Również wzrost lepkości roztworu jest niepożądany i może powodować znaczny wzrost ciśnienia w układzie i utrudnić przechodzenie roztworu przez membranę. Przy wysokich oporach przepływu proces musi być prowadzony przy mniejszej prędkości przepływu, aby nie przekroczyć wytrzymałości membrany. I.2. Odsalanie próbki diafiltracja W procesie diafiltracji można zmniejszyć siłę jonową filtrowanego roztworu (odsalanie) lub wymienić rozpuszczalnik na inny (np. na bufor o innym ph). Proces polega na ciągłym lub okresowym dodawaniu do filtrowanego roztworu odpowiedniego rozpuszczalnika: wody, buforu lub roztworu soli. W tym samym czasie odbierany jest filtrat, w którym znajduje się rozpuszczalnik pierwotny. Retentat zawierający składnik kluczowy jest zawracany do zbiornika zasilającego. Dla procesu okresowego po odebraniu określonej objętości filtratu ( DV na rys. 4) dodawana jest kolejna porcja rozpuszczalnika. Kilkukrotny dodatek nowego rozpuszczalnika sprawia, że stopniowo zastępuje on rozpuszczalnik pierwotny [3]. 5

4 Rys.4. Schemat procesu diafiltracji, czyli następujących po sobie etapów rozcieńczania i zatężania próbki z użyciem membrany, DV objętość diafiltracji (startowa Vpróbki) [3]. II. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest przedstawienie zastosowania filtracji stycznej z użyciem membran do odsolenia i zatężenia roztworu białka w skali semi preparatywnej. III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA III.1. SPRZĘT LABORATORYJNY I ODCZYNNIKI 1. Sprzęt laboratoryjny Aparat do filtracji stycznej Minim II firmy Pall Life Sciences (schemat aparatu przedstawiony na rys.5). Składa się on z: a) jednostki sterującej z panelem kontrolnym na ekranie LCD, b) pompy perystaltycznej o przepływie rpm (ok ml/min), c) membrany Minimate (firmy Pall Life Sciences), maksymalne ciśnienie pracy 4 bar, d) trzech mierników ciśnienia i jednego miernika temperatury, e) zaworu regulującego ciśnienie w układzie przez zmianę natężenia przepływu retentatu, f) kompletu rurek z trójdrożnymi zaworami, g) zbiornika na filtrowany roztwór o pojemności 800 cm 3 z mieszadłem magnetycznym. 6

5 Rys.5. Schemat aparatury do filtracji z użyciem membrany [1]. Chromatograf Äkta prime plus z detektorami: konduktometrycznym i spektrofotometrycznym UV (GE Healthcare Life Sciences, Szwecja). 2. Odczynniki 50 mm bufor fosforanowy ph 7 1,7 M siarczan amonu ph 7 badane białko np. Hemoglobina z krwi bydlęcej, czystość 90%, (firmy Fluka). III.2. OPIS ĆWICZENIA Zbadanie przepuszczalności wody przez membranę (NWP) (na podst. [4]) Zmierzyć objętościowe natężenie przepływu filtratu ( V ml/min) dla odpowiedniego ciśnienia transmembranowego (TMP bar) przy zamkniętym zaworze na retentacie. Uwaga! Nie wolno przekroczyć maksymalnego ciśnienia pracy dla danej membrany (4 bar). V/A NWP, [L/ h m 2 bar] A powierzchnia pracująca membrany: 70 cm 2. TMP 7

6 Sporządzenie roztworu białka Sporządzić pierwotny roztwór białka: Rozpuszczalnik: np. 20% (V/V) r r soli 1.7 M (NH4)2SO4 w buforze ph = 7. Rozpuszczamy odpowiednią naważkę białka w zadanej objętości rozpuszczalnika. Proces diafiltracji Zatężanie Wlać roztwór białka do zbiornika. Przełączyć zawór na retentacie tak, aby jego strumień był zawracany do zbiornika. Następnie włączyć pompę przy ustalonym przepływie. Otworzyć strumień filtratu i zbierać go do cylindra miarowego. Obserwując wskazania ciśnienia (max 4 bar) przykręcić zacisk na retentacie w celu zwiększenia przepływu filtratu. Proces prowadzić do uzyskania kilka razy mniejszej objętości w zbiorniku niż na początku (krotność zatężenia). Cały czas monitorujemy wskazania ciśnienia w układzie. Odsalanie Po odebraniu określonej objętości filtratu wlać taką samą objętość buforu fosforanowego ph = 7 do zbiornika. Proces prowadzić dalej do uzyskania wcześniejszego zatężenia (tej samej objętości filtratu). Powtórzyć operację dodawania buforu i zatężania aż do uzyskania żądanego stopnia odsolenia. Zakończenie procesu W końcowej fazie diafiltracji nie dodawać już nowej porcji buforu w celu uzyskania zatężonego produktu. Zamknąć zawór filtratu i następnie odbierać produkt do momentu spuszczenia całej zawartości zbiornika. Po zakończeniu pracy układ wymyć wodą, a membranę pozostawić w roztworze NaOH. Zbadanie próbek białka Otrzymane próbki zatężonego i odsolonego białka oznaczyć na detektorze chromatografu stosując przepływ przez bypass. Piki chromatograficzne rejestrować przy pomocy detektora UV przy długości fali 280 nm i detektora konduktometrycznego. Przeprowadzić analizę chromatograficzną również dla próbki wzorcowej roztworu białka. 8

7 IV. OPRACOWANIE I DYSKUSJA WYNIKÓW POMIARÓW Wyeksportować z programu PrimeView Evaluation otrzymane chromatogramy z detektora UV i konduktometrycznego. Rys. 6. Przykładowy wykres porównawczy absorbancji białka przed i po procesie. Odczytać wartości pola powierzchni pod pikami białka (detektor UV) i soli (detektor konduktometryczny) przed i po procesie zatężania i odsalania (próbka z filtratu i retentatu) z programu PrimeView Evaluation. Określić stężenie białka w badanych próbkach poprzez porównanie pola powierzchni pod pikiem białka próbki wzorcowej i po procesie zatężania w oparciu o wskazania detektora UV. Określić stężenie soli w badanych próbkach poprzez porównanie pola powierzchni pod pikiem soli próbki wzorcowej i po procesie odsalania w oparciu o wskazania detektora konduktometrycznego. Wyniki obliczeń przedstawić w tabeli: Badana próbka Pole powierzchni pod pikiem białka Stężenie białka [g/dm 3 ] Pole powierzchni pod pikiem soli Stężenie soli [g/dm 3 ] wzorzec retentat filtrat 9

8 W dyskusji wyników należy odnieść się do uzyskanych wartości stężenia i na tej podstawie określić stopień zatężenia i odsolenia roztworu białka. Można również podać propozycje zmian, które poprawią przebieg doświadczenia. LITERATURA [1] Scientific & Technical Report, Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications, Larry Schwartz, Kevin Seeley, Pall Life Sciences, PN [2] Scientific & Technical Report, Diafiltration: A Fast, Efficient Method for Desalting, or Buffer Exchange of Biological Samples, Larry Schwartz, Pall Life Sciences, PN [3] Scientific & Technical Report, Desalting and Buffer Exchange by Dialysis, Gel Filtration or Diafiltration, Larry Schwartz, Pall Life Sciences, PN [4] Care & Use Procedure, Minimate TFF Capsule, Pall Life Sciences, PN