Nr kat. EM03, EM04 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM03, EM04 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA TISSUE przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji DNA o wysokiej czystości z tkanek stałych (świeżych, mrożonych, utrwalonych w formalinie lub zatopionych w parafinie), płynów fizjologicznych, włosów, ogonów gryzoni, owadów oraz linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM03 050 EM03 150 EM03 250 EM03 D TL Buffer (Tissue Lysis Buffer) 20 ml 60 ml 100 ml 1,2 ml RNase A (lyophilized) 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. RNase Buffer 200 µl 600 µl 1 ml 100 µl Proteinase K (lyophilized) 1 szt. 3 szt. 5 szt. 1 szt. Proteinase Buffer 1,3 ml 3,9 ml 6,5 ml 200 µl TB Buffer (conc.)* (Binding Buffer) TW1 Buffer (conc.)* (Wash Buffer 1) TW2 Buffer (conc.)* (Wash Buffer 2) 8,8 ml 26,4 ml 44 ml 1,2 ml** 20 ml 60 ml 100 ml 2,1 ml** 8,2 ml 24,6 ml 41 ml 1,5 ml** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Bead Beating Tubes*** (probówki z kulkami ceramicznymi) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Enzymy RNaza A oraz Proteinaza K dostarczane są w postaci liofilizowanej. K a ż d a p r o b ó w k a z a w i e r a o d p o w i e d n i ą i l o ś ć e n z y m u d o p r z e p r o w a d z e n i a 50 izolacji DNA. Liofilizaty enzymów należy przechowywać w temp. +4 C. Przed pierwszym użyciem liofilizat RNazy A należy rozpuścić w 200 µl RNase Buffer (w zestawie DEMO w 100 µl RNase Buffer). RNaza A w roztworze przechowywana w temp. +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeśli wymagane jest ***Odnosi sie wyłącznie do zestawu EXTRACTME DNA TISSUE PLUS. Probówki z kulkami do homogenizacji (Bead Beating Tubes) posiadają wypełnienie cyramiczne. 3
przechowywanie RNazy A przez dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNazy i przechowywanie w temp. -20 C. Liofilizat proteinazy K należy rozpuścić w 1,3 ml Proteinase Buffer (w zestawie DEMO w 200 µl Proteinase Buffer). Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. -20 C! Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. *Przed pierwszym użyciem do TB, TW1 i TW2 Buffers należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. ** Uwaga: w zestawie DEMO (EM03 D) TB, TW1 i TW2 Buffers zawierają już etanol. LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM03 050 EM03 150 EM03 250 TB Buffer 8,8 ml 26,4 ml 44 ml Etanol 96 100% 13,2 ml 39,6 ml 66 ml Całkowita objętość 22 ml 66 ml 110 ml TW1 Buffer 20 ml 60 ml 100 ml Etanol 96 100% 20 ml 60 ml 100 ml Całkowita objętość 40 ml 120 ml 200 ml TW2 Buffer 8,2 ml 24,6 ml 41 ml Etanol 96 100% 19,2 ml 57,6 ml 96 ml Całkowita objętość 27,4 ml 82,2 ml 137 ml III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT 96 100% etanol cz.d.a. jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na 1,5 2 ml probówki (>10 tys. rpm) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) worteks www.dnagdansk.com 4
Nr kat. EM03, EM04 Opcjonalnie ksylen bloczki parafinowe bufor PBS linie komórkowe, tkanki w formalinie, płyny fizjologiczne przygotowanie: rozpuścić 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 oraz 0,24 g KH 2 PO 4 w 800 ml H 2 O. Dodać HCl do ph 7,4. Dopełnić do 1000 ml i autoklawować. Przechowywać w temp. +4 C. 1 M DTT włosy przygotowanie: 1,54 g DTT rozpuścić w 10 ml H 2 O. Rozporcjować i przechowywać w temp. -20 C. nożyczki, skalpel probówki z kulkami ceramicznym (nr kat. HPLM100; lub w zestawie EXTRACTME DNA TISSUE PLUS, nr kat. EM04) homogenizator tkankowy na probówki 2 ml homogenizator nożowy termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm moździerz z gładkim wylewem (50 75 ml) z dopasowanym pistonem ciekły azot lub suchy lód worteks z przystawką na probówki 2 ml wirówka z rotorem na probówki 10 15 ml (płyny fizjologiczne, linie komórkowe). IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA składa się z 5 etapów i jest przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Pierwszym etapem jest homogenizacja tkanki, mająca na celu dezintegrację połączeń międzykomórkowych (tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację wysokocząsteczkowych białek (tkanka mięśniowa, łączna). Następnie homogenat poddawany jest lizie enzymatycznej z wykorzystaniem zoptymalizowanego TL Buffer oraz proteinazy K. Na tym etapie degradacji ulegają błony oraz wszystkie białka komórkowe. W przypadku tkanki aktywnej metabolicznie, RNA jest usuwane przy zastosowaniu RNazy A. Po zwirowaniu celem eliminacji niestrawionych resztek tkanki, supernatant zmieszany z solami chaotropowymi nanoszony jest na złoże minikolumny. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. 5
V. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY tkanka stała świeża lub mrożona: 1 30 mg tkanka utrwalona w formalinie: 1 30 mg tkanka w bloczku parafinowym: 1 30 mg linie komórkowe: 10 3 10 7 komórek płyny fizjologiczne (mocz, PMR, płyn otrzewnowy): 1 5 ml włosy: 1 30 mg ogony gryzoni: 1 30 mg owady: 1 30 mg WYDAJNOŚĆ IZOLACJI Przykładowe wydajności izolacji DNA ze świeżego materiału biologicznego podane są w sekcji XIII. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 50 µg DNA CZAS IZOLACJI ok. 12 minut (po etapie lizy) 30 40 minut w przypadku homogenizacji mechanicznej 1 16 h w przypadku zastosowania okresowego worteksowania CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1,7 1,9 www.dnagdansk.com 6
Nr kat. EM03, EM04 VI. KONTOLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA TISSUE testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qpcr oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Tkanka jest materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze klasy II bezpieczeństwa biologicznego, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć najpierw wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu. 7
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 100 200 μl Elution Buffer przy izolacji z 2 10 mg tkanki lub <10 4 komórek oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego do 200 μl w przypadku izolacji z 10 30 mg tkanki lub 10 4 10 7 komórek. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 50 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W przypadku małej ilości materiału wyjściowego lub materiału o niskiej zawartości DNA zaleca się przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji DNA według standardowych procedur. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt. 16 19 Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer zawiera 0,5 mm EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA). Do elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mm Tris-HCl, ph 8,0-9,0, innych buforów do specyficznych aplikacji, o ph i stężeniu soli zbliżonych do tego buforu lub wody (ph 7,0-9,0). Zanieczyszczenia RNA Większość świeżych lub mrożonych tkanek zawiera więcej RNA niż DNA, szczególnie tkanki aktywne metabolicznie, tj. gruczoły, tkanka nerwowa, nabłonki. Obecność RNA może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych, ale nie wpływa na inhibicję PCR. W celu otrzymania oczyszczonego preparatu genomowego DNA wolnego od RNA należy dodać 4 μl roztworu RNase A i inkubować 5 min w temp. 37 C (pkt. 3 Protokołu izolacji). Pienienie TL Buffer Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym może dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu usunięcia piany probówkę należy wirować przez 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). www.dnagdansk.com 8
Nr kat. EM03, EM04 IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer). 3. W razie potrzeby przygotować roztwór RNase A poprzez rozpuszczenie liofilizatu w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 4. Należy upewnić się czy do TB, TW1 i TW2 Buffers dodany został etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 5. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (TW1, TW2 Buffers) lub 50 60 C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 6. Nagrzać termoblok, termomikser lub łaźnię wodną do temp. 55 C. 7. Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 8. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 9. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. X. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: 1 30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie. Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze f r a g m e n t y. P r z e j ś ć d o w y b o r u m e t o d h o m o g e n i z a c j i ( p o n i ż e j ) l u b p r z e j ś ć do pkt. 1 Protokołu izolacji (sekcja XI). Ciekły azot, suchy lód (LN 2, CO 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 lub CO 2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć. 2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 375 μl TL Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 375 μl TL Buffer i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki (2 ml), nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki. 9
Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl TL Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. P o u z y s k a n i u h o m o g e n a t u, o p ł u k a ć k o ń c ó w k ę n o ż o w ą z a p o m o c ą 275 μl TL Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml). 3. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych (polecamy zestaw EXTRACTME DNA TISSUE PLUS, nr kat. EM04, w skład którego wchodzą dodatkowo probówki z kulkami - Bead Beating Tubes) 1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 150 μl TL Buffer i przenieść pociętą tkankę. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez 30 s przy 5 6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie konieczności. W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki spowodowanej pienieniem buforu probówkę zwirować przez 2 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy maksymalnych obrotach. 2. Dodać 225 μl TL Buffer, wymieszać przez pipetowanie. 3. Do probówki dodać 25 μl Proteinase K oraz 4 μl RNase A. Zworteksować przez 20 s. Inkubować 5 min w temp. 37 C. 4. Przejść do pkt. 4 Protokołu izolacji (sekcja XI). B. TKANKA UTRWALONA W FORMALINIE Ilość: 1 30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce przechowywane w 4% formalinie w warunkach chłodniczych przez minimum 60 minut. 1. Usunąć formalinę poprzez dwu lub trzykrotne przepłukanie tkanki roztworem PBS lub H 2 O. Formalina jest drażniąca. Nie zaleca się sprawdzania prawidłowości odpłukania formaliny przez wąchanie oparów z probówki. 2. Dalej postępować jak w przypadku tkanek świeżych (pkt. X.A). www.dnagdansk.com 10
Nr kat. EM03, EM04 C. TKANKA ZATOPIONA W PARAFINIE Ilość: 1 30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce zatopione w bloczkach parafinowych według standardowej procedury histologicznej. 1. Z bloczka parafinowego wyciąć fragment o masie max 30 mg i umieścić w probówce (2 ml). 2. Dodać 1 ml ksylenu. Worteksować przez 30 s. Ksylen jest toksyczny, drażniący i bardzo palny. Pracować pod włączonym wyciągiem. 3. Wirować 5 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). Usunąć supernatant przez pipetowanie. 4. Powtórzyć etapy 2 3. 5. Dodać 1 ml 96 100% etanolu. Wymieszać przez pipetowanie lub worteksowanie 15 s. 6. Wirować 2 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). Usunąć supernatant przez pipetowanie. 7. Powtórzyć etapy 5 6. 8. Suszyć osad w temp. 50 C w otwartej probówce przez 5 20 min celem pozbycia się etanolu. 9. Dodać 375 μl TL Buffer, wymieszać przez worteksowanie przez 20 s. 10. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). D. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: 10 3 10 7 komórek; Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. 1. Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37 C lub RT. Komórki w pożywce lub PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g). Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 375 μl TL Buffer. W y m i e s z a ć p r z e z i n t e n s y w n e w o r t e k s o w a n i e 3 0 s, a następnie pipetowanie. Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 7 ) mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w TL Buffer. Należy wtedy rozpipetować ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet. 3. Całość przenieść do nowej probówki (2 ml). 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). 11
E. PŁYNY FIZJOLOGICZNE Ilość: do 5 ml płynu; Materiał: mocz, płyn mózgowo rdzeniowy, płyn z jamy otrzewnej, opłucnej, plwocina. Do izolacji DNA z krwi polecamy dedykowany zestaw EXTRACTME DNA BLOOD, a do izolacji z wymazów lub nasienia zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN. Płyny fizjologiczne są materiałem cennym diagnostycznie, a jednocześnie stanowią duże zagrożenie ze względu na potencjalną zawartość patogenów i/lub komórek nowotworowych. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z tym materiałem. 1. Mocz oraz inne płyny: w zależności od objętości, zwirować w odpowiedniej probówce/falkonie przez 5 min przy 2 tys. rpm (ok. 500 x g). Supernatant odrzucić. Plwocina: przed wirowaniem należy dodać odpowiednią ilość środka mukolitycznego (bromheksyna, acetylocysteina). Wirować 5 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g). Supernatant odrzucić. 2. Osad komórkowy przepłukać za pomocą 1 ml PBS lub soli fizjologicznej, wirować 1 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g). 3. Dodać 375 μl TL Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s. 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). F. WŁOSY Ilość: 10 30 mg włosów (ok. 100 120 sztuk), do 30 mg cebulek włosa. Materiał: włosy, najlepiej z cebulkami lub same cebulki. Tylko cebulki zawierają żywe komórki, natomiast w pozostałej części włosa znajdują się resztki komórek ze zdegradowanym gdna oraz mtdna. Stąd też aplikacje, takie jak PCR lub qpcr, powinny uwzględniać produkty o wielkościach 200 pz. 1. Cebulki odciąć od włosów i umieścić w probówce (2 ml). Jeśli włosy pozbawione są cebulek, pociąć je na fragmenty o długości maksymalnie 3 mm. 2. Dodać 375 μl TL Buffer. Dodać 40 μl 1M DTT oraz 25 μl Proteinase K. Wymieszać przez worteksowanie 30 s. Dodatek DTT jest opcjonalny. Większość rodzajów włosów powinna ulec strawieniu bez dodatku tego odczynnika, jednakże niektóre rodzaje włosów (np. kręcone) zawierają zbyt dużą ilość mostków dwusiarczkowych, uniemożliwiających całkowite potrawienie samą Proteinazą K. 3. Inkubować minimum 6 h (lub przez noc) w temp. 55 C. Należy okresowo worteksować przez 1 2 min. Polecany jest termomikser. 4. Po całkowitym potrawieniu przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja XI). W przypadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji DNA według standardowych procedur. www.dnagdansk.com 12
Nr kat. EM03, EM04 G. OGONY GRYZONI Ilość: do 30 mg; Materiał: ogon szczura lub myszy. 1. Ogon pociąć nożyczkami lub skalpelem na jak najmniejsze fragmenty i umieścić w probówce (2 ml). W celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej (patrz pkt. X.A). 2. Dodać 375 μl TL Buffer, intensywnie worteksować przez 20 s. 3. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w temp. 37 C przez 5 min, następnie w temp. 55 C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h przy dobrej homogenizacji lub 5 16 h przy pracy na pociętych fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 4. Przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja XI). H. OWADY Ilość: 1 30 mg; Materiał: owady w różnych stadiach rozwoju; świeże, mrożone, utrwalone w formalinie lub etanolu. 1. Owady utrwalone w formalinie lub etanolu przemyć dwukrotnie za pomocą 1 ml PBS lub dh 2 O, wirować 1 min przy 2 tys. rpm (ok. 500 x g). W zależności od stopnia fragmentacji utrwalonego materiału przejść do pkt. 3 lub przeprowadzić etap homogenizacji (pkt. 2). 2. Homogenizacja pociąć owady na jak najmniejsze fragmenty. Ucierać w moździerzu w ciekłym azocie na proszek, następnie przenieść do probówki (2 ml). Można także zastosować kulki ceramiczne (według procedury opisanej w pkt. X.A). W celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej. 3. Dodać 375 μl TL Buffer, intensywnie worteksować przez 60 s. 4. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w temp. 37 C przez 5 min, następnie w temp. 55 C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h przy dobrej homogenizacji lub 5 16 h przy pracy na pociętych fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 5. Przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja XI). W przypadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji DNA według standardowych procedur. 13
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2 ml). Dodać 375 μl TL Buffer. Worteksować przez 20 s. W przypadku pienienia roztworu należy go zwirować przez 1 2 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 2. Dodać 25 μl Proteinase K i wymieszać przez odwracanie probówki. 3. Umieścić probówkę w termobloku, termomikserze lub łaźni wodnej w temp. 55 C i inkubować do czasu całkowitego potrawienia materiału biologicznego. Po każdych 30 60 min probówkę intensywnie worteksować przez 20 s. 4. Opcjonalnie dodać 4 μl roztworu RNase A. Inkubować 5 min w temp. 37 C. Usuwanie RNA zalecane jest szczególnie w przypadku tkanek aktywnych metabolicznie oraz gdy niezbędne jest wyizolowanie DNA całkowicie wolnego od RNA. 5. Dodać 400 μl TB Buffer i wymieszać przez worteksowanie 10 s. 6. Wirować 2 min przy 10 14 tys. rpm (11 21 tys. x g). 7. Przenieść ostrożnie supernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej, uważając, żeby nie zaciągnąć resztek niepotrawionej tkanki. W przypadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych należy ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając końcówkę pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć supernatant. Resztki tkanki powinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie probówki. 8. Wirować 1 min przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). Po wirowaniu w minikolumnie nie powinno być płynu. W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części minikolumny należy powtórzyć wirowanie przez 2 min przy maksymalnej prędkości. 9. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). www.dnagdansk.com 14
Nr kat. EM03, EM04 10. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego TW1 Buffer i wirować 30 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 11. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. 12. Dodać do minikolumny 500 μl TW2 Buffer i wirować 30 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 13. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. 14. Wirować 1-2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 15. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 16. Nanieść 100-200 μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20-200 μl. Więcej wskazówek dotyczących tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 17. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 18. Wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. g). 19. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub temp. -20 C do czasu dalszych analiz. 15
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Niska wydajność izolacji DNA. Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. Tkanka źle przechowywana i/lub utrwalona degradacja DNA. Tkanka nieprawidłowo rozdrobniona. Brak dostatecznej lizy tkanki. Zmniejszona aktywność proteinazy K. Zatkana minikolumna. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody. Niekompletna degradacja białek. Zmniejszona aktywność proteinazy K. Przechowywać tkankę w temp. -80 C. Unikać częstego rozmrażania i zamrażania. W przypadku utrwalania upewnić się, że utrwalacz jest dobrej jakości, a warunki przechowywania są odpowiednie. Upewnić się, że tkanka została odpowiednio zhomogenizowana w TL Buffer. Tkankę należy uprzednio pokroić na jak najmniejsze fragmenty a następnie dobrać odpowiednią metodę homogenizacji. Należy zapewnić optymalne warunki dla działania Proteinazy K. W tym celu należy upewnić się czy tkanka jest dostatecznie rozdrobniona, wydłużyć okres worteksowania, inkubować tkankę w mieszaninie TL Buffer + Proteinase K do 16 h. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. 20 C. W przypadku pracy z materiałem opisanym w sekcji X.B,C,E,H należy starannie przemyć osad komórkowy roztworem PBS. Patrz Zatkana minikolumna. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. Użyć świeżej proteinazy K. Wydłużyć czas worteksowania, inkubować tkankę w TL Buffer + Proteinase K do czasu, aż roztwór będzie klarowny. Złe warunki przechowywania proteinazy K. W przypadku pracy z materiałem opisanym w sekcji X.B,C,E,H należy starannie przemyć osad komórkowy roztworem PBS. www.dnagdansk.com 16
Nr kat. EM03, EM04 Zatkana minikolumna. Zdegradowane DNA. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Kontaminacja RNA. Przeładowanie minikolumny. Materiał niewystarczająco rozdrobniony. Niekompletna degradacja białek. Przeniesienie osadu komórkowego na złoże minikolumny. Tkanka zbyt stara. Niewłaściwe przechowywanie i/lub utrwalanie tkanki. DNA fizycznie zdegradowane przez zbyt gwałtowną homogenizację. Resztki buforu płuczącego TW2 Buffer w eluacie. Tkanka o wysokiej zawartości RNA. Nie przekraczać zalecanej ilości tkanki lub komórek. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji (sekcja X.A). Użyć świeżej proteinazy K. Wydłużyć czas worteksowania, inkubować tkankę w TL Buffer + Proteinase K do czasu, aż roztwór będzie klarowny. Ostrożnie przenieść supernatant bez naruszania resztek komórek. Używać tkanek świeżych lub odpowiednio utrwalonych. Przechowywać tkankę w temp. -80 C. Unikać częstego rozmrażania i zamrażania. W przypadku utrwalania upewnić się, że utrwalacz jest dobrej jakości, a warunki przechowywania są odpowiednie. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji (sekcja X.A). Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.14) nie pozostało żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie. Przeprowadzić trawienie RNase A (pkt. 4 Protokołu izolacji). 17
XIII. WYDAJNOŚCI IZOLACJI DNA ZE ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO Materiał Masa/ilość Objętość elucji Stężenie DNA A 260 /A 280 Ilość DNA Wątroba szczura 30 mg 200 µl 235,2 ng/µl 1,86 47,0 µg Mięsień szkieletowy szczura 20 mg 200 µl 50,5 ng/µl 1,80 10,1 µg Serce szczura 20 mg 200 µl 123,5 ng/µl 1,84 24,7 µg Tkanka tłuszczowa żółta 30 mg 200 µl 49,0 ng/µl 1,80 9,8 µg Tkanka tłuszczowa brunatna 30 mg 200 µl 116,7 ng/µl 1,88 23,3 µg Nerka szczura 20 mg 200 µl 183,4 ng/µl 1,79 36,7 µg Linie komórkowe HT29 1 x 10 5 200 µl 51,5 ng/µl 1,81 10,3 µg Linie komórkowe HCT116 3 x 10 6 200 µl 60,0 ng/µl 1,61 12,0 µg Mózg szczura 20 mg 200 µl 9,4 ng/µl 1,69 1,88 µg Owady 2,7 mg 30 µl 12,9 ng/µl 1,65 0,39 µg XIV. CZAS OBRÓBKI ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO Materiał Trawienie w termobloku, bez homogenizacji, worteksowanie okresowe Trawienie w termomikserze Homogenizacja w ciekłym azocie Homogenizacja z kulkami ceramicznymi Wątroba szczura 3 6 h 2 4 h 1 2 h 1 h Mięsień szkieletowy szczura 2 3 h 2 h 1 h 0,5 1 h Serce szczura 2 3 h 1 1,5 h 1 h 0,5 1 h Tkanka tłuszczowa żółta Tkanka tłuszczowa brunatna 1 1,5 h 1 h 0,5 h 0,5 h 1 1,5 h 1 h 0,5 h 0,5 h Nerka szczura 1,5 3 h 0,5 2 h 0,5 1,5 h 0,5 1,5 h Linie komórkowe HT29 Linie komórkowe HCT116 0,5 1 h 5 30 min Brak danych ok. 5 min 0,5 1 h 5 30 min Brak danych ok. 5 min Mózg szczura 0,5 1 h 0,5 1 h Brak danych Brak danych Owady Brak danych 1 2 h 0,5 2 h 0,5 2 h Orientacyjny całkowity czas lizy Min. 1 h Max 6 h Min. 0,5 h Max 3 h Min. 0,5 h Max 3 h Min. 0,5 h Max 1,5 h Min. 0,5 Max 1,5 h Min. 0,5 h Max 3 h Min. 5 min Max 1 h Min. 5 min Max 1 h Min. 0,5 h Max 1 h Min. 0,5 h Max 2 h www.dnagdansk.com 18
Nr kat. EM03, EM04 XV. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM TL, TB, TW1 BUFFERS Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, P280, P305+P351+P338 PROTEINASE K Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311 TW2 BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P261, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem.
www.dnagdansk.com