Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych Nr kat. EM03 Wersja zestawu: 1.2012
I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA CLEAN-UP przeznaczony jest do szybkiego i wydajnego oczyszczania fragmentów DNA po reakcjach enzymatycznych. Oczyszczone DNA wolne jest od nukleaz, inhibitorów enzymów, detergentów, enzymów restrykcyjnych, polimeraz, kationów dwuwartościowych, soli itp., gwarantując wysoką użyteczność w technikach biologii molekularnej. Zestaw umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA o wielkościach od 50 pz do 30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA. Ekstrakcja cząsteczek DNA mniejszych od 100 pz oraz większych od 10 kpz zachodzi jednak z obniżoną wydajnością. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiego odzysku, jak i czystości oczyszczanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU Liczba izolacji 50 izolacji 150 izolacji 250 izolacji 3 izolacje (DEMO) Nr katalogowy EM07-050 EM07-150 EM07-250 EM07-D CB Buffer (Binding Buffer) 25 ml 75 ml 125 ml 1,5 ml CW Buffer (conc.)* (Wash Buffer) 11 ml 33 ml 55 ml 3 ml** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. *Przed pierwszym użyciem do roztworu CW Buffer należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki.
50 150 250 Liczba izolacji izolacji izolacji izolacji Nr katalogowy EM07-050 EM07-150 EM07-250 (ph 7,0 9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, QPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. CW Buffer 11 ml 33 ml 55 ml Etanol 96-100% 44 ml 132 ml 220 ml Całkowita objętość 55 ml 165 ml 275 ml **Uwaga: w zestawie DEMO (EM07-D) CW Buffer zawiera już etanol. Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA CLEAN-UP testowana jest według wewnętrznych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU III. IV. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol 96 100% cz.d.a. jałowe próbówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5 2 ml (> 10 tys. rpm) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) 3 M octan sodu, ph 5,2 (w nielicznych przypadkach) ZASADA IZOLACJI Materiał wyjściowy Próbka DNA o objętości do 100 µl Odzysk 90 99% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie 100 pz 10 kpz) Wielkość izolowanych fragmentów DNA 100 pz 10 kpz Możliwe jest również oczyszczanie fragmentów DNA w zakresach 50 100 pz i 10 30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA, lecz z obniżoną wydajnością. Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Do próbki DNA dodawany jest CB Buffer, który powoduje denaturację białek oraz umożliwia efektywne wiązanie DNA do złoża. Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który pozwala na kontrolowanie ph roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża. Dwuetapowe przemywanie minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża minikolumny buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą Pojemność złoża ok. 25 µg DNA Czas izolacji 5 10 minut Czystość DNA A 260/A280 = 1,7-2,0
VII. środki ostrożności IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Przenieść odpowiednią objętość próbki DNA (nie więcej niż 100 µl) do jałowej probówki 1,5 2ml typu Eendorf. Próbki DNA przed oczyszczaniem można przechowywać w warunkach wolnych od deoksyrybonukleaz (DNaz) w temp. +4 C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy okres czasu. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek DNA.W przypadku wytrącenia się osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 50 60 C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości DNA zawartego w próbce oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30 100 μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może to obniżyć wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Maksymalny odzysk DNA można uzyskać poprzez przeprowadzenie elucji w objętości 200 µl lub dwóch kolejnych etapów elucji po 100 µl (do różnych probówek Eendorfa). Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych. Kontrolowanie poziomu ph CB Buffer zawiera wskaźnik ph, pozwalający na sprawdzenie czy ph mieszaniny jest mniejsze niż 7,5 (kolor żółty), co gwarantuje wydajną adsorpcję DNA do złoża minikolumny. Gdy ph jest wyższe niż 7,5, roztwór zmieni barwę na różową. Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy wartość ph próbki DNA bardzo odbiega od standardowych warunków wykorzystywanych przy operacjach z DNA (ph > 9,0). Konieczne jest wtedy dodanie 10 µl 3 M octanu sodu (ph 5,2), który obniżając ph próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost ph CB Buffer powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA do złoża w minikolumnie. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy upewnić się czy do CW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach CB lub CW, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 5. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej. 6. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Do 1 obj. próbki DNA dodać 5 obj. CB Buffer (np. do 50 µl mieszaniny po reakcji PCR dodać 250 µl CB Buffer), worteksować 3 s. Sposób przygotowania próbki opisano w sekcji IX. Przygotowanie próbki. Kolor mieszaniny powinien być żółty. Jeżeli po roztwór zmienił barwę na purpurową, należy dodać 10 µl 3 M roztworu octanu sodu o ph 5,2 i wymieszać (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). 2. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka probówki, a następnie przenieść całą objętość mieszaniny na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 3. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 4. Dodać do minikolumny 600 μl CW Buffer i wirować 30 s przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 5. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 6. Dodać do minikolumny 400 μl CW Buffer i wirować 2 min przy 12 14 tys. rpm (15 21 tys. x g). 7. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Bufory płuczące zawierają alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. W tym celu po drugim etapie płukania można dodać etap wirowania na sucho. Po opróżnieniu probówki odbierającej, należy wirować suchą kolumnę przez 1 min przy 12 14 tys. rpm (15 21 tys. x g). 8. Nanieść 50 100 μl Elution Buffer podgrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20 200 µl. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji IX. Szczególne zalecenia i uwagi. 9. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 10. Wirować 1 min przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 11. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub 20 C do czasu dalszych analiz.
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Problem Niska wydajność izolacji DNA. Prawdopodobna przyczyna Nieefektywne wiązanie DNA do złoża. Rozwiązanie Upewnić się, że po dodaniu CB Buffer mieszanina posiada żółte zabarwienie. W przypadku zmiany barwy na różową, należy dodać 10 µl 3 M octanu sodu o ph 5,2. CB BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, H411, P273, P280, P305+P351+P338 Niedodany etanol do buforu płuczącego. Upewnić się, że 96 100% etanol został dodany w odpowiedniej ilości do CW Buffer. CW BUFFER Niecałkowita elucja DNA. Podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer (do 10 minut). Przeprowadzić powtórną elucję. Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311 Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Do elucji użyć Elution Buffer. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Nieostre prążki w obrazie elektroforetycznym. DNA wypływa ze studzienek w żelu agarozowym. Obecność etanolu w próbce. Obecność soli w próbce. Obecność nukleaz w buforze elucyjnym. Obecność etanolu w próbce. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Po drugim etapie płukania przeprowadzić etap wirowania na sucho. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać w temp. pokojowej. Upewnić się, że w CW Buffer nie wytrącił się osad. Wymienić zanieczyszczony bufor elucyjny na nowy. Gdy do elucji zamiast Elution Buffer używa się wody, upewnić się, że jest ona wolna od DNaz. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Po drugim etapie płukania przeprowadzić etap wirowania na sucho. H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. H411 Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać.
BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80 172 Gdańsk, T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: info@dnagdansk.com