Zastosowanie proteomiki w diagnostyce klinicznej wybranych chorób limfoproliferacyjnych

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(2): 153-158 Praca poglądowa Review Article Zastosowanie proteomiki w diagnostyce klinicznej wybranych chorób limfoproliferacyjnych Clinical application of proteomics in the diagnosis of selected lymphoproliferative diseases Wiesława Nahaczewska 1, Iwona Urbanowicz 1, Jolanta Stacherzak Pawlik 2, Mieczysław Woźniak 2 1 Zakład Hematologii Laboratoryjnej, Katedra Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, 2 Zakład Chemii Klinicznej, Katedra Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu Streszczenie Badania proteomiczne znalazły zastosowanie w szeroko pojętej diagnostyce medycznej, umożliwiając znalezienie różnic w profilach białkowych w komórkach osób zdrowych i dotkniętych chorobą. Różnice te mogą być przyczyną lub konsekwencją choroby. Efektywność badań proteomicznych wynika z możliwości wykorzystania nowoczesnych analitycznych i bioinformatycznych narzędzi badawczych, co skutkuje szybką i wiarygodną oceną wielu białek równocześnie. Zastosowanie proteomiki m.in. w badaniach nad chorobami limfoproliferacyjnymi przyczyniło się do odkrycia nowych białek przydatnych w diagnostyce tego rodzaju nowotworów. Technikami proteomicznymi potwierdzono również istnienie biomarkerów wykrytych wcześniej innymi metodami. W publikacji przedstawiono doniesienia dotyczące badań proteomicznych w diagnostyce wybranych chorób limfoproliferacyjnych (chłoniaków), które należą do jednych z najbardziej heterogennych i trudnych diagnostycznie schorzeń hematoonkologicznych. (Diagn Lab 2014; 50(2): 153-158) Summary Proteomic studies have been applied in medical research and diagnostics as a powerful tool to find the differences between healthy and sick individuals protein profiles. Such differences could be either a reason or a consequence of the disease. The effectiveness of proteomics derives from the possibility of designing and application of modern analytical methods and bioinformatic tools which enables the reliable assessment of many proteins during relatively short time. Application of proteomics in the research on lymphoproliferative diseases resulted in the discovery of new protein markers, as well as it confirmed the existence of biomarkers revealed earlier using other methods. This paper attempts to present the communications concerning the application of proteomics in the diagnostics of lymphomas, which are considered to be a very diversified and diagnostically difficult group of hematological disorders. (Diagn Lab 2014; 50(2): 153-158) Słowa kluczowe: choroby limfoproliferacyjne, proteomika Key words: lymphoproliferative diseases, proteomic Wstęp Proteomika jest dziedziną nauki, zajmującą się badaniem struktury, funkcji i zależności między białkami danej komórki lub danego organizmu [1, 2]. Termin proteom (PROTein complement of the genome kompletny materiał genetyczny organizmu) oznaczający wszystkie białka kodowane przez genom został po raz pierwszy zaproponowany przez Marca R. Wilkinsa w 1994 roku [3, 4]. Dzięki projektowi HUGO (Human Genome Project, Projekt Genomu Ludzkiego) ustalono, że genom ludzki zawiera około 40 000 genów kodujących białka, natomiast w ludzkim proteomie jest około 500 000 białek [2]. Genom pozostaje niezmieniony przez całe życie organizmu, natomiast proteom zmienia się w wyniku alternatywnego splicingu podczas translacji i powstawania informacyjnego mrna a także procesów modyfikacji posttranslacyjnej, takich jak fosforylacja czy glikozylacja, które wpływają na ostateczną strukturę i funkcję białka [2, 3]. Oznacza to, że ludzki proteom jest bardziej skomplikowany niż genom, a na jeden gen przypada około dziesięciu różnych rodzajów białek. Zasadniczym celem proteomiki jest globalne scharakteryzowanie całego proteomu bez wybiórczej analizy poszczególnych jego elementów. Organizacją, która dąży do opisania proteomu ludzkiego i stworzenia bazy danych jest HUPO (Human Proteome Organization, Organizacja Proteomu Ludzkiego). Dodatkowym celem jaki stawia sobie HUPO jest standaryzacja metod badawczych, która sprawiłaby, 153

www.diagnostykalaboratoryjna.eu że otrzymywane wyniki byłyby wiarygodne oraz powtarzalne pomiędzy różnymi laboratoriami [5, 6, 7, 8]. Stowarzyszenie HUPO opracowało kilka obszarów badawczych, z których kluczowe znaczenie dla nauki genomika Charakterystyka struktury genomu i genów, analiza sekwencji DNA i ekspresji genów ma bioinformatyka jako interdyscyplinarna dziedzina wiedzy. Umożliwia ona opracowywanie algorytmów i programów mających na celu gromadzenie i analizę wyników eksperymentów proteomicznych [5, 7, 8]. Charakterystyka funkcji Analiza profilu genomu na poziomie i statusu Z bioinformatyką powiązana jest genomika, metabolomika proteomu bioinformatyka metabolicznego i proteomika, co w konsekwencji przyczynia się do znacznego postępu w analizie badań ludzkiego proteomu, jak również oceny struktury genomu i genów oraz szybkiego wzrostu i scentralizowania zasobów bazy danych biologicznych [8, 9, 10, 11] (ryc. 1). Współczesna proteomika reprezentuje dwa podstawowe kierunki badań: pierwszy szukający proteomikia Rycina 1. Zakres badań genomiki, proteomiki i metabolomiki [11] metabolomikia przyczyny rozwoju procesu patologicznego, drugi zmierzający do wykorzystania biomarkerów w diagnostyce medycznej [10]. Ciągły przepływ informacji pomiędzy tymi kierunkami badawczymi przyczynia się do poszerzenia wiedzy na temat molekularnych chłoniaków złośliwych. W grupie chorób limfoproliferacyjnych mieszczą się także chłoniaki złośliwe z obrazem białaczkowym we krwi obwodowej czyli przewlekłe białaczki: limfocytowa i włochatokomórkowa. podstaw rozwoju schorzeń [10, 12]. Istotą proteomiki klinicznej jest nie tylko wygenerowanie listy białek znajdujących się w określonym narządzie czy tkance, ale przede wszystkim poszukiwanie różnic w profilach białkowych pomiędzy osobami zdrowymi i chorymi. Różnice te mogą być przyczyną jak i konsekwencją choroby [5, 12, 13]. Choroba jako proces dynamiczny modyfikuje włączanie i wyłączanie ekspresji określonych genów, co skutkuje zmianą stosunków ilościowych i jakościowych produkowanych i wydzielanych białek. Charakterystyka tych białek może służyć do poszukiwania i weryfikowania biomarkerów nowotworowych w celach diagnostycznych, prognostycznych i predykcyjnych [13, 14, 15, 16]. Diagnostyka nowotworów złośliwych układu chłonnego, do których należą chłoniak ziarniczy (HL Hodgkin s Lymphoma ), chłoniaki nieziarnicze (NHLs Non Hodgkin s Lymphomas) poza oceną histologiczną uwzględnia również oznaczanie niespecyficznych biomarkerów w surowicy krwi, takich jak: dehydrogenaza mleczanowa (LDH), kwas moczowy, β2-mikroglobulina. Wraz z rozwojem nauki próbuje się wykorzystać w diagnostyce chłoniaków badania oparte o metody proteomiczne takie jak: elektroforeza jedno i dwuwymiarowa, Western blotting, spektrometria masowa z zastosowaniem technik jonizacji MALDI lub SELDI, tandemowa spektrometria masowa MS/ MS czy mikromacierze DNA. Wykorzystanie powyższych technik badawczych w różnych kombinacjach i w połączeniu z bazami danych stwarza możliwość analizy setek a nawet tysięcy profili białkowych [17, 18]. Przewlekła białaczka limfocytowa Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL Chronic Lymphocytic Leukemia) jest najczęściej rozpoznawaną postacią białaczki wśród osób dorosłych. Charakteryzuje się bardzo zróżnicowanym przebiegiem klinicznym, co najlepiej odzwierciedla różnorodny czas przeżycia, wahający się od kilku miesięcy do kilkudziesięciu lat. Pomimo dostępnej chemioterapii, CLL wciąż pozostaje chorobą nieuleczalną [20, 21, 22]. Cechą charakterystyczną tej jednostki chorobowej jest nowotworowa proliferacja dojrzałych morfologicznie i niesprawnych czynnościowo limfocytów. Limfocyty CLL posiadają charakterystyczny immunofenotyp z obecnością powierzchniowych antygenów: CD19+, CD20+, CD23+ oraz CD5+ [21, 22]. W przebiegu CLL można wyodrębnić dwie grupy chorych w zależności od obecności lub braku somatycznej mutacji genu dla regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny ( ). Stan zmutowania genu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny ( ) jest jednym z najważniejszych czynników prognostycznych w przewlekłej białaczce limfocytowej. Brak mutacji rokuje niekorzystnie, obserwuje się szybką progresję choroby, krótszy czas przeżycia, złą odpowiedź na leczenie. Natomiast obecność mutacji przemawia za powolnym przebiegiem choroby i możliwym wieloletnim przeżyciem bez progresji [21, 23, 24]. Fakt ten przyczynił się do zwiększonego zainteresowania poszukiwaniem markerów związanych z mutacją, z wykorzystaniem technik proteomicznych. Jednym z nich jest niereceptorowa białkowa kinaza tyrozynowa ZAP-70 (Zeta- Charakterystyka wybranych chorób limfoproliferacyjnych Choroby limfoproliferacyjne chłoniaki złośliwe są biologicznie i histologicznie niejednorodną grupą schorzeń nowotworowych wywodzących się z układu chłonnego. Charakteryzują się nadmierną klonalną proliferacją limfocytów, najczęściej typu B. Dotyczą zarówno dzieci jak i osób dorosłych, częściej chorują mężczyźni niż kobiety [19, 20, 21]. Chłoniaki nieziarnicze stanowią ok.70 %, a chłoniak ziarniczy ok. 30% wszystkich rozpoznawanych -chain-associated Protein kinase 70) odgrywająca kluczową rolę w molekularnej sygnalizacji limfocytów T i NK, jak również w ich dojrzewaniu i różnicowaniu. W warunkach fizjologicznych białko to występuje tylko na powierzchni limfocytów T i NK [25]. Wiestner i wsp. oceniali ekspresję ZAP-70 w CLL w 2 grupach pacjentów: z niezmutowanym genem (UM-CLL, unmutated CLL) oraz zmutowanym genem (M-CLL, mutated CLL). Wykazali korelację pomiędzy obecnością mutacji genu dla a ekspresją ZAP- 154

Diagn Lab 2014; 50(2): 153-158 70. U większości pacjentów grupy UM-CLL występowała ekspresja ZAP-70, co wiązało się z gorszym rokowaniem i krótszym czasem przeżycia chorych [25]. W grupie chorych ze zmutowanym genem (M-CLL), obecność białka ZAP-70 wykazano jedynie sporadycznie, co wiązało się z lepszym rokowaniem i dłuższym czasem przeżycia [25]. Obserwacje te nie pozwalają jednak na wysunięcie wniosku, że obecna ekspresja białka ZAP-70 jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym zależnym od braku mutacji [25, 26]. Wymagają one dalszych badań. Inni autorzy Schroers i wsp. jak również Hayat wykazali, że zwiększona ekspresja molekuły CD38 może być przydatnym czynnikiem rokowniczym w CLL, chociaż poziom jej ekspresji może ulegać wahaniom podczas rozwoju choroby. Badacze stwierdzili, że poziom ekspresji CD38 koreluje z niezmutowanym stanem genu, podobnie jak ZAP- 70 [26, 27]. Obecność ekspresji CD38 stwierdzono w większości przypadków UM-CLL, jak również wykazano, że ekspresja CD38 jest zmienna i niezależna od stanu mutacji genu. Nie jest więc dobrym markerem prognostycznym w przewlekłej białaczce limfocytowej [27, 28]. Niemniej jednak, dla bardziej precyzyjnej oceny stanu zaawansowania choroby i podjęcia decyzji odnośnie wdrożenia leczenia określa się ekspresję CD38 z uwagi na fakt, że u znacznej grupy chorych jej ekspresja dobrze koreluje z dynamiką choroby [28]. Z kolei Boyd i wsp. dokonali szczegółowej analizy białek wchodzących w skład błon komórkowych komórek nowotworowych i wykazali wysoką ekspresję białka BCNP1 i MIG2B w limfocytach CLL, jak również w innych chłoniakach linii B komórkowej [29]. Powyższe badania pozwalają na wysunięcie przypuszczenia, iż białko BCNP1 może być markerem chłoniaków linii komórkowej B gdyż wysoki poziom białka MIG2B wykazano również w nowotworach linii T komórkowej. Rola białka BCNP1 w patogenezie CLL nie jest jeszcze dobrze poznana [29]. Kluczową rolę w regulacji apoptozy pełni białko p53 współdziałające z rodziną białek Bcl-2. Zdolność białka p53 do przerwania cyklu komórkowego w celu naprawy uszkodzeń komórki czy indukcja zaprogramowanej śmierci komórki jest jego podstawową funkcją [30]. Choroby nowotworowe mogą powodować mutacje w genie p53, prowadząc do utraty zdolności kompleksowego współdziałania białek z rodziny Bcl-2 a ostatecznie do zaburzeń apoptozy [30, 31]. Badania przeprowadzone przez Cordone i wsp. wykazały ekspresję zmutowanego białka p53 u około 15% pacjentów z CLL. Dane te korelowały z gorszą odpowiedzią pacjentów na leczenie, wyższym stadium zaawansowania klinicznego choroby, krótszym czasem przeżycia chorych [32]. Działanie antyapoptotyczne białka Bcl-2 oraz proapoptotyczne białka Bax wydają się być kolejnym ważnym wyznacznikiem przebiegu apoptozy limfocytów w CLL. Wykazano, iż wysoka ekspresja białek Bcl-2 wiąże się z krótszym czasem przeżycia chorych [33]. Niska wartość wskaźnika Bcl-2/Bax koreluje z łagodnym przebiegiem choroby oraz lepszą odpowiedzią na leczenie, podczas gdy u pacjentów z wysokim wskaźnikiem Bcl-2/Bax obserwowano zaburzenia apoptozy nowotworowych limfocytów oraz ich oporność na chemioterapię [33]. Nie wykazano związku ekspresji białek Bcl-2 i Bax ze stanem mutacji genu i ekspresją ZAP-70. Jednak u pacjentów z ekspresją molekuły CD38 zaobserwowano znacznie podwyższoną ekspresję biała Bcl- 2 i znacznie obniżoną Bax [33]. Należące do rodziny Bcl-2, białko Mcl-1, pełni również funkcję w regulacji apoptozy limfocytów CLL. Zaobserwowano, że ekspresja Mcl-1 koreluje ze stopniem zaawansowania przewlekłej białaczki limfocytowej, czasem podwojenia limfocytozy i stanem mutacji genu [33]. Badania Peppera i wsp. potwierdziły niski odsetek odpowiedzi terapeutycznej u chorych na CLL przy zastosowaniu chlorambucylu, fludarabiny i rytuksymabu, u których stwierdzono wysoką ekspresję białka Mcl-1. Autorzy pracy sugerują, iż obniżenie aktywności białka Mcl- 1 może uruchomić proces apoptozy komórek nowotworowych w odpowiedzi na chemioterapię [33]. W prawidłowym rozwoju limfocytów typu B bierze również udział niereceptorowa kinaza tyrozynowa c-abl. Zwiększoną ekspresję c-abl zaobserwowano u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową z niezmutowanym genem. Wykazano, że nadekspresja c-abl koreluje ze stadium zaawansowania choroby, a także masą guza. Ponieważ ekspresja białka ZAP-70 jest najczęściej związana z brakiem mutacji genu, sugeruje to również możliwą korelację pomiędzy ekspresją białka ZAP 70 a białkiem c-abl [34]. Białaczka włochatokomórkowa W diagnostyce białaczki włochatokomórkowej (HCL Hairy Cell Leukemia) ważną rolę przypisuje się białku aneksynie A1 (ANXA1). Badania przeprowadzone przez Faleni B. i wsp. wykazały obecność ekspresji tego białka w komórkach u 97% chorych na HCL. U pozostałych chorych na HCL, w tym HCL variant oraz w śledzionowym chłoniaku strefy brzeżnej wykazano niską ekspresję ANXA1 lub jej brak. Sugeruje to, że aneksyna A1 mogłaby być specyficznym markerem dla białaczki włochatokomórkowej wykorzystanym w różnicowaniu z innymi nowotworami linii B komórkowej [35]. Chłoniak z komórek płaszcza Chłoniak z komórek płaszcza (MCL Mantle Cell Lymphoma) charakteryzuje się agresywnym przebiegiem i stosunkowo krótkim czasem przeżycia wynoszącym 3 do 5 lat. Chromosomalna translokacja t(11;14), którą stwierdza się u większości chorych na MCL powoduje zaburzenia cyklu komórkowego. Konsekwencją tych zmian jest nadmierna ekspresja cykliny D1, która jest czułym i specyficznym markerem MCL [20, 21, 36]. U części chorych na MCL nie występuje translokacja t(11;14), pozostałe cechy morfologiczne, fenotypowe i zmiany genetyczne są identyczne jak u chorych cyklino D1 dodatnich. Te nieliczne przypadki kliniczne wykazują ekspresję cyklin D2 i D3, które stwierdzane są również w innych chłoniakach B-komórkowych. U chorych z rozpoznaniem MCL cyklino D1ujemnym wykazano natomiast nadekspresję białka jądrowego SOX11. Obecność białka SOX11 jak również cechy morfologiczne i fenotypowe MCL cyklino D1 ujemnego bez translokacji t(11:14) okazały się być istotnym markerem różnicującym tego chłoniaka z innymi chłoniakami z małych limfocytów B [37, 38]. Gualco i wsp. wśród chorych na MCL z najbardziej charakterystyczną ekspresją antygenów CD20, CD5, cykliny D1 oceniali ekspresję dwóch białek: onkogenu Bcl-6, najczęstszego zaburzenia molekularnego w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B oraz onkogenu MUM1 (Multiple myeloma oncogene 1), którego ekspresję stwierdza się m.in. w różnych stadiach rozwojowych limfocytów B. Tylko w 12% 155

www.diagnostykalaboratoryjna.eu przypadków MCL obecna była ekspresja białka Bcl-6 a w 35% przypadków ekspresja białka MUM1. W grupie chorych na MCL, Bcl-6 dodatnich, ekspresja MUM1 występowała u 67% chorych. Obserwacje te wymagają jednak dalszych badań [39]. Chłoniak grudkowy Chłoniak grudkowy (FL Follicular Lymphoma) ze względu na podstępny rozwój rozpoznawany jest zazwyczaj w zaawansowanych stadiach klinicznych. Początkowej fazie chłoniaka grudkowego towarzyszy niebolesne powiększenie węzłów chłonnych, z kolei w późniejszej fazie choroby występuje nacieczenie szpiku kostnego heterogenną grupą komórek o typie centrocytów i centroblastów. Ilość centroblastów decyduje o podtypie (G1, G2, G3) chłoniaka grudkowego. Do ustalenia jego podtypu mogą też być wykorzystane badania proteomiczne [20]. Wykazano, że białko histon H4 ze względu na zróżnicowaną ekspresję może być potencjalnym markerem pozwalającym na rozróżnienie podtypu G1 od G3 chłoniaka grudkowego [40]. Translokacja t(14;18) w chłoniaku grudkowym aktywuje gen białka antyapoptycznego Bcl-2, którego zwiększoną ekspresję stwierdza się we wszystkich podtypach FL, natomiast nie stwierdza się ekspresji tego białka w prawidłowych ośrodkach namnażania limfocytów B [40, 41]. W nielicznych przypadkach chorych na FL wykazano ekspresję białka Bcl-6, co wiązało się z dłuższym czasem przeżycia chorych [42]. Białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T Wśród białaczek z dużych ziarnistych limfocytów (LGL Large Granular Lymphocytic Leukemia) w oparciu o fenotyp immunologiczny wyróżniamy białaczki z limfocytów T lub z komórek NK. Liczne badania wykazały, że w T-LGL występuje zwiększona ekspresja wielu genów kodujących enzymy proteolityczne, które są związane z funkcją cytotoksyczną limfocytów. Należą do nich: granzym B i M, katepsyny C i W, perforyny oraz kaspazy [43, 44]. Granzym B i M inicjują proces apoptozy poprzez fragmentację DNA niszczonej komórki. Badania w grupie chorych na T-LGL potwierdziły wysoką aktywność granzymu B, co pozwala uznać to białko za marker limfocytów T, z kolei granzym M jest białkiem cytotoksycznym charakterystycznym dla komórek NK oraz cytotoksycznych dziewiczych limfocytów T [43]. Chłoniak anaplastyczny wielkokomórkowy Chłoniak anaplastyczny wielokomórkowy (ALCL Anaplastic Large Cell Lymphoma) charakteryzuje się wysokim stopniem złośliwości, częściej występuje u dzieci i młodych osób, z przewagą u mężczyzn. W obrazie histologicznym chłoniaka ALCL występują duże heterogenne limfocyty CD30+, które w przeważającej mierze prezentują fenotyp limfocytów T lub komórek null. Postać skórna ALCL wywodzi się prawdopodobnie z zasiedlających skórę limfocytów T, najczęściej CD8 i CD4+ z obecnością cytotoksycznych cząstek TIA1 (T-cell restricted intracellular antygen-1), perforyny i granzymu B [44, 45]. Układowy chłoniak anaplastyczny rozwija się w węzłach chłonnych, jak również występuje poza węzłowo. Najczęściej zajmuje kości, tkanki miękkie, płuca i wątrobę. W większości przypadków występuje zaburzenie genetyczne w postaci translokacji t(2;5) prowadzące do fuzji genu nukleofosminy na chromosomie 5 z genem ALK na chromosomie 2. Powstaje gen kodujący hybrydową kinazę tyrozynową, NMP/ ALK (nucleophosmin/anaplastic lymphoma kinase) o aktywności onkogennej. Stwierdzenie ekspresji tego genu lub jego braku pozwala na wyróżnienie dwóch odrębnych jednostek chorobowych: ALCL ALK+ i ALCL ALK [44]. Anaplastyczny chłoniak wielkokomórkowy ALK+ wiąże się najczęściej z dobrym rokowaniem, w przeciwieństwie do ALCL ALK-, w którym rokowanie jest niepomyślne [45]. Komórki układowego chłoniaka ALCL ALK+ wywodzą się z dojrzałych cytotoksycznych limfocytów T z ekspresją części ich antygenów, z których CD3 i CD8 są zazwyczaj ujemne. W większości przypadków można stwierdzić obecność białek cytotoksycznych typu granzym B, perforyna, TIA1 oraz istotną diagnostycznie obecność nabłonkowego antygenu błonowego EMA [45, 46]. Z kolei komórki chłoniaka układowego ALCL ALK poza antygenem CD30+ wykazują ekspresję CD2+, CD3+ CD4+ jak również obecność cytotoksycznych protein typu granzym B, perforyna i TIA1, nie stwierdza się natomiast obecności ekspresji nabłonkowego antygenu błonowego EMA [46, 47]. Cussac i wsp. w badaniach na liniach komórkowych chłoniaka ALCL ALK+ wykazali wysoką ekspresję białek szoku cieplnego rodziny HSP70, odpowiadających za ochronę komórek przed stresem [47]. Natomiast w komórkach chłoniaka ALCL ALK wykazali znamienną aktywność serpiny B9. Wysoki odsetek komórek serpino-b9 dodatnich wiązał się z niekorzystną prognozą dla tych chorych gdyż serpina B9 inaktywując proteinazy serynowe powoduje zwiększoną oporność komórek chłoniaka ALCL ALK na granzym B indukujący apoptozę [47]. Chłoniak Hodgkina Chłoniak Hodgkina (HL Hodgkin Lymphoma) charakteryzuje się obecnością ziarniczych komórek Hodgkina (H) i Reed Sternberga (R-S) oraz nadmierną ilością reaktywnych komórek pozapalnych w zajętym chorobą węźle chłonnym. Przyjmuje się, że komórki nowotworowe H i R-S są klonalną linią B komórkową, które utraciły typowe markery tej linii CD19, CD79A, CD79B i nabyły aktywność antygenu CD30, który występuje również w anaplastycznym chłoniaku wielokomórkowym (ALCL) i jest przyczyną częstych problemów diagnostycznych pomiędzy tymi jednostkami chorobowymi [48]. Przyczyna przeprogramowania komórek linii B jest mało poznana. Jedną z nich jest najprawdopodobniej nieprawidłowa ekspresja wczesnego czynnika linii B EBF1 (eary B-cell factor), która prowadzi do utraty prawidłowego fenotypu komórek linii B [48]. W etiologii HL uwzględnia się także zakażenie wirusem EBV (Epstein Barr virus) [49, 50]. Klasyfikacja HL opiera się na obrazie histologicznym zajętego narządu i rzutuje na przebieg kliniczny i leczenie chłoniaka [19, 20]. Wallentine i wsp. zidentyfikowali grupę białek: BRAF, PIM1 i ErbB-3, które wcześniej nie były kojarzone z procesem patogenetycznym chłoniaka Hodgkina. Białka te związane są z czynnikiem transkrypcyjnym NF-kB, ze szlakiem sygnałowym kinaz serynowo treoninowych aktywowanych miogenami Ras/Raf/MAPK/ERK. Ten wewnątrzkomórkowy szlak przekazywania sygnałów mitogennych do jądra komórkowego poprzez serię fosforylacji cząstek tworzących tę ścieżkę, reguluje 156

Diagn Lab 2014; 50(2): 153-158 funkcje komórki takie jak: proliferacja, różnicowanie i apoptoza. Zaburzenia tego szlaku mogą prowadzić do transformacji nowotworowej [50]. Białko BRAF jest jednym z elementów składowych wyżej wymienionego szlaku kinaz aktywowanych miogenem, kontroluje wzrost i rozwój komórek. Białko PIM1 jest serynowo treoninową kinazą zaangażowaną również w proces proliferacji i różnicowania komórek. Infekcja wirusem EBV prawdopodobnie powoduje zaburzenia funkcji białka PIM1, konsekwencją czego jest możliwość jego penetracji do komórek linii B, co predysponuje zakażone komórki do transformacji nowotworowej oraz utraty zdolności do apoptozy [50]. Nadekspresję białka ErbB-3, błonowego receptora kinazy tyrozynowej zaobserwowano w raku piersi, ekspresję tego białka wykazano również w szpiczaku mnogim [50]. Wallentine i wsp. zwrócili także uwagę na rolę innych białek: Axyna1, Tenascyn-X, Mucyna-2 i CD100 w rozwoju HL, dotychczas nie uwzględnianych w badaniach nad chłoniakiem Hodgkina. Analiza proteomiczna w połączeniu z analizą bioinformacyjną sugerują potencjalną użyteczność tych białek w diagnostyce chłoniaka Hodgkina [50]. Dane literaturowe ostatnich lat wskazują na istotną rolę komórek dendrytycznych grudek limfatycznych zlokalizowanych w ośrodkach namnażania węzłów chłonnych w procesie apoptozy komórek B [51]. Wykazano, że biomarkery obecne na komórkach dendrytycznych grudek limfatycznych są również stwierdzane na komórkach H, R-S chłoniaka Hodgkina oraz chłoniaka ALCL. Kim i wsp. opisali białka: GLI3 (glioma associated homologue 3), TUBB3 (class III β-tubulin), fascynę (fascin) jako diagnostycznie istotne dla obu chłoniaków. Częstość i ekspresja wyżej wymienionych markerów nie zależała od typu histologicznego chłoniaka Hodgkina oraz nie wykazywała związku z zakażeniem wirusem EBV. Autorzy zalecają ostrożność w interpretacji znaczenia diagnostycznego nowych markerów z uwagi na ich koekspresję w komórkach endotelialnych i fibroblastach podścieliska [51]. Podsumowanie Głównym celem badań proteomicznych jest ustalenie wzoru ekspresji białek i ich sekwencji oraz modyfikacji potranslacyjnych, zarówno w stanach fizjologicznych jak i patologicznych. Siłą proteomiki jest możliwość porównywania próbek biologicznych zawierających ogromną liczbę białek, przy czym ostatecznym wynikiem jest znalezienie stosunkowo niewielkiej liczby najistotniejszych różnic pomiędzy nimi. Zainteresowanie proteomiką w badaniach nad nowotworami nasiliło się z chwilą gdy stwierdzono, że identyfikacja i charakterystyka szczegółowa jedynie DNA i mrna nie będzie wystarczająca do oceny mechanizmów powstawania tych chorób i identyfikacji nowych markerów oraz punktów uchwytu dla nowych leków. Zastosowanie proteomiki w praktyce klinicznej wspólnie z innymi nowoczesnymi strategiami biomedycznymi (genomika, metabolomika) jest szansą na zrozumienie istoty samych nowotworów oraz poprawienie ich diagnostyki i leczenia. Zróżnicowanie patogenetyczne i morfologiczne chorób limfoproliferacyjnych stwarza wciąż trudności diagnostyczne. Analiza proteomu ukierunkowana na chłoniaki złośliwe to doskonałe narzędzie służące poznaniu ich czynników patogenetycznych i prognostycznych, jak również nadzieja na postęp w zakresie odkrywania nowych, skuteczniejszych i bezpieczniejszych leków. Piśmiennictwo 1. Futoma-Kołoch B, Bugla-Płoskońska G. Metody badawcze stosowane w badaniach białek ze szczególnym uwzględnieniem technik elektroforetycznych SDS. Laboratorium 2007; 9: 46 49. 2. Dmitrzak-Węglarz M, Hauser J. Wykorzystanie badań proteomicznych w poszukiwaniu markerów biologicznych dla chorób psychicznych. Psychiatria 2006; 3: 118-127. 3. Tomaszewska K, Nalewaj J, Markowska J. Proteomika nowa metoda oznaczania markerów nowotworowych. Rak jajnika. Onkologia Polska 2005; 8. 79-81. 4. Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, et al. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotech Genet Eng Rev 1996; 13: 41-50. 5. Kossowska B, Dudka I, Gancarz R, i wsp. Analiza proteomiczna profili białkowych w niektórych stanach patologicznych ludzkiego organizmu; Postepy Hig Med Dosw 2009; 63: 549-563. 6. Webside: Welcome to the Human Proteome Organisation (HUPO) 2011http:// www.hupo.org/ 7. Merrick BA. The Human Proteome Organization (HUPO) and Environmental Health. EHP. Toxicogenomics 2003; 6: 797 801. 8. Diamandis EP. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunieties and potential limitations. Molec Cell Proteom 2004: 3, 367-378. 9. Higgs PG, Attwood TK. Bioinformatyka i ewolucja molekularna. Wyd Nauk PWN 2008; 10-13. 10. Kraj A, Drabik A, Silberring J. Proteomika i metabolomika. Wyd UW 2010; 10-12, 49-59, 64, 66, 185, 282, 333, 361, 373, 379-385, 401-409, 501-503. 11. Webside: Joint Genomic Center. About us. 2010 http://www.jgc-bg.org/ 12. Silberring J. Problemy proteomiki klinicznej trendy, niebezpieczeństwa i problemy. Postepy Biol Kom 2009; 36: 111-115. 13. Tulewicz E. Proteomika kliniczna nadzieja diagnostyki medycznej. Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi. 2008; 1-2. 14. Lewandowicz A, Bakun M, Imiela J, i wsp. Proteomika w uronefrologii nowe perspektywy diagnostyki nieinwazyjnej? Nefrol Dial Pol 2009: 1, 15-21. 15. Azad NS, Rasool N, Annunziata CM, et al. Proteomics in clinical trials and practice: present uses and future promise. Mol Cell Proteomics 2006; 10, 1819-1829. 16. Monti M, Orru S, Pagnozzi D, et al. Functional proteomics. Clin Chim Acta, 2005; 357: 140 150. 17. Cristea IM, Gaskell SJ, Whetton AD. Proteomics techniques and their application to hematology. Blood 2004; 103: 3624 3634. 18. Miguet L, Bogumil R, Decloquement P, et al. Discovery and identification of potential biomarkers in a prospective study of Chronic Lymphoid Malignancies using SELDI-TOF MS. J Proteom Res 2006; 5: 2258-2269. 19. Dembińska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Urban and Partner 2008; 76: 83. 20. Dmoszyńska A. Wielka Interna, Hematologia.Medical Tribune Polska 2011; 35, 45, 141, 145, 148, 446-447, 481, 468, 488, 490, 525, 527. 21. Provan D, Singer Ch RJ, Baglin T. Hematologia kliniczna. PZWL 2006; 209 235. 22. Urbanowicz I, Nahaczewska W, Stacherzak-Pawlik J i wsp. Starzenie się limfocytów i jego wpływ na rozwój przewlekłej białaczki limfocytowej. Diagn Lab 2013; 49: 137 144. 23. Duncan AE, Cochran CA, Evans BD, et al. Proteomic Analysis of Chronic Lymphocytic Leukemia Subtypes with Mutated or Unmutated Ig VH Genes. Mol and Cell Prot 2003; 2: 1331-1341. 24. Merle-Béral H, Herbrecht R, Béné MC, et al. A unique proteomic profile on surface IgM ligation in unmutated chronic lymphocytic leukemia. Blood 2011; 118: 1-15. 25. Wiestner A, Rosenwald A, Barry TS, et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood 2003; 101: 4944-4951. 26. Schroers R, Griesinger F, Trümper L, et al. Combined analysis of ZAP-70 and CD38 expression as a predictor of disease progression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2005; 19: 750-758. 157

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 27. Hayat A. CD38 expression level and pattern of expression remains a reliable and robust marker of progressive disease in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma 2006; 47: 2371-2379. 28. Ghia P, Guida G, Scielzo C, et al. CD38 modifications in chronic lymphocytioc leukemia: are they relevant? Leukemia 2004; 18: 1733-1735. 29. Boyd RS, Ada PJ, Patel S, et al. Proteomic analysis of the cell-surface membrane in chronic lymphocytic leukemia: identification of two novel proteins, BCNP1 and MIG2B. Leukemia 2003; 17: 1605-1612. 30. Alsafadi S, Tourpin S, Andre F, et al. P53 family: at the crossroads in cancer therapy. Curr Med Chem 2009; 16: 4328 4344. 31. Vousden KH, Prives C. P53 and prognosis: new insights and further complexity. Cell 2005; 120: 7-10. 32. Cordone M, Masi S, Mauro FR, et al. P53 expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a marker of disease progression and poor prognosis. Blood 1998; 91: 4342-4349. 33. Pepper C, Lin TT, Pratt G, et al. Mcl-1 expression has in vitro and in vivo significance in chronic lymphocytic leukemia and is associated with other poor prognostic markers. Blood 2008; 112: 3807-3817. 34. Lin K, Glenn MA, Harris RJ. c-abl expression in chronic lymphocytic leukemia cells: clinical and therapeutic implication. Cancer Res 2006; 66: 7801-7809. 35. Falini B, Tiacci E, Liso A. Simple diagnostic assay for hairy cell leukaemia by immunocytochemical detection of annexin A1 (ANXA1). Lancet 2004; 363: 1869-1870. 36. Sriganeshan V, Blom TR, Weissmann DJ. A unique case of mantle cell lymphoma with a aberrant CD5-/CD10+ immunophenotype and typical morphology. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 1346 1349. 37. Szymczyk M, Walewski J. Chłoniak z komórek płaszcza współczesne poglądy na diagnostykę i leczenie. Via Medica 2010; 4: 330 341. 38. Mozos A, Royo C, Hartmann E. et al. SOX11 expression is highly specific for mantle cell lymphoma and identifies the cyclin D1-negative subtype. Haematologica 2009; 94: 1555-1562. 39. Gualco G, Lawrence MW, Weiss LM, et al. BCL-6, MUM1 and CD10 expression in mantle cell lymphoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2010; 18, 103-108. 40. Fan G, Molstad M, Braziel RM, et al. Proteomic profiling of mature CD 10+ B-Cell Lymphomas. Am J Clin Pathol 2005; 124: 920-929. 41. Boyd R.S., Dyer M.J.S., Cain K.: Proteomic analysis of B-cell malignancies. J Proteomics 2010; 73: 1804-1822. 42. Bilalovic N, Blystad AK, Golouh R, et al. Exspression of bcl-6 and CD10 protein is associated with longer overall survival and time to treatment failure in Follicular Lymphoma. Am J Clin Pathol 2004; 121: 34-42. 43. Morice WG, Jevremovic D, Hanson CA. The expression of the novel cytotoxic protein granzyme M by large granular lymphocytic leukaemias of both T-cell and NK-cell lineage: an unexpected finding with implications regarding the pathobiology of these disorders. Brit J Haematol 2007; 137: 237 239. 44. Amin H, Lai R. Pathobiology of ALK+ anaplastic large cell lymphoma. Blood 2007; 110: 2259 2267. 45. Felgar RE, Salhany KE, Macon WR, et al. The expression of TIA-1+ cytolytic type granules and other cytolytic lymphocyte associated markers in CD30+ anaplastic large cell lymphomas (ALCL): correlation with morphology, immunophenotype, ultrastructure and clinical features. Hum Pathol 1999; 30: 228 236. 46. Kothapalli R, Bailey RD, Kusmartseva I, et al. Consitutive expression of cytotoxic proteases and down-regulation of protease inhibitors in LGL leukemia. Inter J Oncol 2003; 22: 33 39. 47. Cussac D, Pichereaux C, Colimba A, et al. Proteomic analysis of anaplasitic lymphoma cell lines: identification of potential tumor markers. Proteomics 2006; 6: 3210-3222. 48. Bohle V, Doring C, Hansmann ML, et al. Role of early B-cell factor 1 (EBF1) in Hodgkin lymphoma. Leukemia 2013; 27: 671 679. 49. Tiacci E, Doring C, Brune V, et al. Analizing primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells to capture the molecular and cellular pathogenesis of classical Hodgkin Lymphoma. Blood 2012; 120: 4609 4619. 50. Wallentine JC, Kim KK, Seiler CE, et al. Comprehensive identification of proteins in Hodgkin lymphoma-derived, Reed-Sternberg cells by LC-MS/MS. Lab Invest 2007; 87: 1113-1124. 51. Kim SH, Choe J, Jeon Y, et al. Frequent expression of follicular dendritic cell markers in Hodgkin Lymphoma and anaplastic large cell lymphoma. J Clin Pathol 2013, 66: 589 596. Adres do korespondencji: dr n. farm. Wiesława Nahaczewska Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu Zakład Hematologii Laboratoryjnej, Katedra Analityki Medycznej 50 556 Wrocław, ul. Borowska 211 A tel. +48 71 7840623 email: wieslawa.nahaczewska@umed.wroc.pl Zaakceptowano do publikacji: 9.04.2014 158