Atypowa morfologia limfocytów: niekorzystny rokowniczo czynnik związany z ekspresją antygenu CD38 na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Transkrypt

1 14 S. Chełstowska i wsp.: Atypowa morfologia limfocytów: niekorzystny rokowniczo czynnik ORIGINAL PAPERS / PRACE ORYGINALNE Atypowa morfologia limfocytów: niekorzystny rokowniczo czynnik związany z ekspresją antygenu CD38 na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej Sylwia Chełstowska, Jarosław Wajs, Anna Krystek, Ewa Drozd, Piotr Rzepecki Wojskowy Instytut Medyczny w Warszawie, Centralny Szpital Kliniczny Ministerstwa Obrony Narodowej, Klinika Hematologii z Ośrodkiem Transplantacji Szpiku Kostnego STRESZCZENIE Atypowa morfologia limfocytów: niekorzystny rokowniczo czynnik związany z ekspresją antygenu CD38 na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej Chełstowska S., Wajs J., Krystek A., Drozd E., Rzepecki P. Wojskowy Instytut Medyczny w Warszawie, Centralny Szpital Kliniczny Ministerstwa Obrony Narodowej, Klinika Hematologii z Ośrodkiem Transplantacji Szpiku Kostnego Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. Family Med., 2014; Vol. 20, No. 1 SUMMARY Atypical lymphocytes morphology: an adverse prognostic factor associated with CD38 expression on chronic lymphocytic leukemia cells Chełstowska S., Wajs J., Krystek A., Drozd E., Rzepecki P. Military Institute of Medicine in Warsaw, Poland, Central Clinical Hospital of the Ministry of National Defense, Department of Hematology with Bone Marrow Transplantation Ward Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. Family Med., 2014; Vol. 20, No. 1 Celem pracy była oceniana częstości występowania atypowych limfocytów u pacjentów z CD38 pozytywną i CD38 negatywną postacią przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL). Materiał i metody. Morfologię komórek ocenialiśmy uwzględniając kryteria Grupy Francusko-Amerykańsko-Brytyjskiej (FAB). Dodatkowo wykorzystaliśmy podstawowe parametry planimetryczne dla komórek i jąder komórkowych. W ten sposób obiektywnie i jednoznacznie dokonaliśmy podziału na typowe i atypowe formy limfocytów, uzyskując dla większości badanych cech różnice statystycznie znamienne. Wyniki. Atypowa morfologicznie PBL występowała zdecydowanie częściej u pacjentów CD38+ (93%) niż u pacjentów CD38- (20%). Słowa kluczowe: przewlekła białaczka limfocytowa, czynniki rokownicze, atypowa morfologia limfocytów, antygen CD38 The aim of the study was to investigate the incidence of atypical lymphocytes in patients with CD38 positive and CD38 negative type of chronic lymphocytic leukemia (CLL). Material and methods. Cell morphology we evaluated using French-American-British Group (FAB) criteria. In addition, we used basic planimetric parameters of cells and cells nuclei. In this way, we objectively and clearly made a distinction between typical and atypical forms of lymphocytes, to obtain for most evaluated features statistically significant differences. Results. Morphologically atypical CLL occurred more frequently in CD38+ patients (93%) than in CD38- patients (20%). Key words: chronic lymphocytic leukemia, prognostic factors, atypical lymphocytes morphology, CD38 antigen Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) jest najczęściej rozpoznawanym nowotworem układu krwiotwórczego. Występuje z częstością 2,4 przypadków nowych zachorowań rocznie na mieszkańców. Choroba rozwija się głównie u osób starszych i dwa razy częściej dotyczy mężczyzn. Niektórzy autorzy sugerują, że PBL nie jest jedną chorobą. U znacznego odsetka pacjentów postępuje powoli i w okresie kilkuletniej obserwacji nie wymaga leczenia cytostatycznego. W innych grupach pacjentów przebieg choroby jest agresywny, wiąże się z koniecznością wczesnego użycia chemioterapii

2 Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. Family Med., 2014; Vol. 20, No i znacznie skraca oczekiwany czas przeżycia. Z tego względu wybór optymalnego leczenia powinien być ustalany indywidualnie dla każdego chorego w oparciu o znane czynniki rokownicze [1]. Zaawansowanie kliniczne, liczba limfocytów we krwi i czas jej podwojenia, stopień nacieczenia szpiku, stężenie w surowicy dehydrogenazy mleczanowej oraz beta-2-mikroglobuliny są związane bezpośrednio z dużą masą nowotworu i jego aktywnością proliferacyjną. Z tego względu poszukuje się nowych biologicznych czynników rokowniczych, które nie byłyby zależne od rozległości procesu białaczkowego i pozwoliłyby ocenić ryzyko postępu PBL we wczesnym stadium klinicznym. Do takich markerów zalicza się m.in.: stan mutacji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobulin (IgV H ), ekspresję błonową antygenu CD38 na białaczkowych limfocytach, cytoplazmatyczną ekspresję białka ZAP-70, aberracje chromosomalne klonu nowotworowego np. delecja 17p i delecja 11q [2]. Atypowa morfologia limfocytów białaczkowych jest uważana za rokowniczo niekorzystny czynnik. Morfologicznej klasyfikacji PBL w tym względzie dokonała FAB przeszło trzydzieści lat temu. W późniejszym czasie pojawiły się prace sugerujące związek pomiędzy atypową morfologicznie PBL i występowaniem określonych aberracji chromosomalnych klonu nowotworowego [3]. Korzystając z bogatego archiwum preparatów cytologicznych zgromadzonych w Klinice Hematologii WIM, postanowiliśmy dokonać retrospektywnej analizy pacjentów z PBL, poszukując związku między morfologią komórek białaczkowych a częstością występowania antygenu CD38 na limfocytach B. MATERIAŁY I METODY Badaniem objęto 47 nieleczonych dotąd pacjentów z PBL hospitalizowanych w Klinice Hematologii WIM w latach PBL rozpoznano uwzględniając kryteria Grupy Roboczej Narodowego Instytutu Raka (NCI-WG). U wszystkich pacjentów we krwi obwodowej obecna była limfocytoza co najmniej 5x10 9 /L z charakterystycznym immunofenotypem (CD5 i CD23 pozytywne limfocyty B). Charakterystyka morfologiczna. Rozmazy krwi obwodowej barwiono metodą Giemsy i oglądano w mikroskopie świetlnym pod powiększeniem x Oceny morfologicznej i pomiarów morfometrycznych dokonano korzystając z cyfrowego systemu obrazowania komórek składającego się z mikroskopu świetlnego Olympus BX51 wyposażonego w kamerę cyfrową oraz oprogramowania Olympus Cell-B. Oglądano kolejno 100 limfocytów odnotowując ich wielkość (małe i duże limfocyty), kształt jąder komór- kowych (regularny i nieregularny), obecność jąderek, identyfikowano o morfologii limfoplazmocyta i prolimfocyta. Oceniano następujące parametry planimetryczne i jądra: powierzchnię, obwód, średnicę długą i krótką, polimorfizm (przedstawiany jako odchylenie standardowe dla powierzchni), wskaźnik kształtu (SF shape factor). Za dużego limfocyta uznano komórkę większą od dwóch prawidłowych erytrocytów. Umownie przyjęto wartość powierzchni > 80 m 2 dla dużej B. Zgodnie z ustaleniami FAB, które były później modyfikowane przez innych badaczy, za przypadki PBL o atypowej morfologii uznaliśmy te, które spełniały co najmniej jedno kryterium we krwi obwodowej: powyżej 10% dużych limfocytów; powyżej 10% prolimfocytów; powyżej 10% limfoplazmocytów; powyżej 10% limfocytów z nieregularnymi jądrami komórkowymi. Analizę immunofenotypową przeprowadzono za pomocą 3- lub 4-kolorowej cytometrii przepływowej. Materiał do badań stanowiła krew obwodowa. Populację limfocytów bramkowano stosując ocenę ekspresji antygenu CD45 i SSC. Ponadto zastosowano panel monoklonalnych przeciwciał: CD5, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD38, CD45, CD79b, FMC7, kappa i lambda. Zbierano komórek używając do tego celu cytometru przepływowego FACS Canto II firmy Becton Dickinson. Wyniki analizowano za pomocą programu FACS Diva (Becton Dickinson). W każdym przypadku fenotyp komórek odpowiadał CLL CD20+dim; CD5+; CD23+; CD22+dim, CD79b+dim; kappa lub lambda+dim lub K/L-. Ze względu na występowanie antygenu CD38 na limfocytach B, pacjentów podzielono na dwie grupy: CD38 pozytywnych powyżej 30% ekspresji (n=27) praz CD38 negatywnych poniżej 30% ekspresji (n=20). Przeprowadzono szczegółową charakterystykę morfologiczną obu grup i porównano je względem siebie w zakresie ocenianych parametrów morfologicznych i planimetrycznych. Dla analizy danych parametrycznych zastosowano test t-studenta. WYNIKI Uwzględniając kryteria FAB atypową morfologię limfocytów stwierdzono 25 pacjentów CD38 pozytywnych (93%) oraz u 4 pacjentów CD38 negatywnych (20%). Odsetek dużych limfocytów (ryc. 1) oraz limfocytów z nieregularnymi jądrami (ryc. 2) był zdecydowanie wyższy w gorzej rokującej grupie pacjentów CD38 dodatnich. Natomiast u większości chorych CD38 ujemnych w rozmazie krwi obwodowej dominowały małe limfocyty z cieniami Gumprechta (ryc. 3).

3 16 S. Chełstowska i wsp.: Atypowa morfologia limfocytów: niekorzystny rokowniczo czynnik Oceniane parametry planimetryczne przedstawiono w formie tabeli (tab. 1). Tabela 1. Wybrane parametry planimetryczne komórek B dla chorych z CD38+ oraz CD38- postacią PBL Table 1. Selected planimetric parameters of B cells for patients with CD38+ and CD38- variant chronic lymphocytic leukemia Ryc. 1. Atypowe duże limfocyty we krwi obwodowej, (barwienie Giemsy, powiększenie x1000) Fig. 1. Atypical large lymphocytes in peripheral blood (Giemsa staining, magnification x1000) Ryc. 2. Atypowe limfocyty z nieregularnymi jądrami we krwi obwodowej (barwienie Giemsy, powiększenie x1000) Fig. 2. Atypical lymphocytes with irregular nucleus in peripheral blood (Giemsa staining, magnification x1000) Parametr znamienbadany N=27 N=20 ność Powierzchnia 82.8 m m 2 p < Powierzchnia 61.4 m m 2 p < jądra Polimorfizm 23.7 m m 2 p < Polimorfizm 12.2 m m 2 p < jądra Obwód 36.4 m 30.9 m p < Obwód jądra 32.6 m 27.2 m p < Średnica 11.5 m 10.2 m p < długa Średnica 10.2 m 8.3 m p < długa jądra Średnica 9.4 m 7.9 m p < krótka Średnica 8.2 m 6.9 m p < krótka jądra Wskaźnik p = 0.89 kształtu Wskaźnik p < kształtu jądra Białaczkowe limfocyty w grupie CD38 pozytywnej miały znacząca większą powierzchnię, nasilony polimorfizm, większy obwód oraz średnicę długą i krótką zarówno w odniesieniu do jak i jądra komórkowego. Wykazane różnice są zgodne z naszymi wcześniejszymi obserwacjami dotyczącymi gorzej rokujących pacjentów z atypową morfologicznie PBL (ryc. 5, 6, 7). OMÓWIENIE Ryc. 3. Małe typowe dla PBL limfocyty z cieniami Gumprechta we krwi obwodowej (barwienie Giemsy, powiększenie x1000) Fig. 3. Small typical for chronic lymphocytic leukemia with Gumprecht s shadows in peripheral blood (Giemsa staining, magnification x1000) Najbardziej popularne systemy rokownicze w PBL tj. Bineta i Rai pozwalają w prosty sposób podzielić chorych na grupy niskiego, pośredniego i wysokiego zaawansowania choroby, natomiast nie dają możliwości przewidywania jej postępu u pacjentów we wczesnym stadium białaczki. Nowe czynniki rokownicze jak stan mutacji genu IgV H, ekspresja antygenu

4 Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. Family Med., 2014; Vol. 20, No % 50% 0% Limfocyty małe [%] 88% Ryc. 4. Częstość występowania typowych, małych limfocytów u pacjentów z CD38+ oraz CD38- postacią PBL Fig. 4. Small typical lymphocytes incidence in patients 40% 30% 20% 10% 0% 46% Limfocyty duże [%] 8% Ryc. 5. Częstość występowania dużych limfocytów u pacjentów z CD38+ oraz CD38- postacią PBL Fig. 5. Large lymphocytes incidence in patients 30% 10% -10% 28% Limfocyty z nieregularnymi jądrami [%] 2% 20% Ryc. 6. Częstość występowania limfocytów z nieregularnymi jądrami u pacjentów z CD38+ oraz CD38- postacią PBL Fig. 6. Lymphocytes with irregular nuclei incidence in patients CD38 oraz białka ZAP-70, pozwalają ocenić ryzyko rozwoju choroby nawet w początkowym okresie PBL. Może to w istotny sposób wpływać na decyzję o rozpoczęciu terapii u pacjentów, u których progresja białaczki po pewnym czasie jej trwania jest nieunikniona. Być może tacy chorzy odniosą korzyść z wcześniej podjętej terapii [4]. W ostatnich 30 latach analizowano rokowniczy wpływ morfologii limfocytów na przebieg PBL, uzyskując niejednoznaczne wyniki. Podczas gdy w niektórych pracach profil morfologiczny komórek B wydawał się nie mieć znaczenia prognostycznego, w zdecydowanej większości innych badań wykazano związek między atypowymi limfocytami i agresywnym przebiegiem choroby, zaawansowanym okresem klinicznym oraz krótszym przeżyciem pacjentów [5]. Obecnie wydaje się, że morfologia limfocytów oprócz wartości diagnostycznej może być użytecznym wskaźnikiem rokowniczym, zwłaszcza dla chorych we wczesnym okresie białaczki. Criel dokonał analizy 390 pacjentów ze świeżo zdiagnozowaną PBL. Typową morfologię komórek B stwierdzono u 300 chorych (77%). Ta postać białaczki była częściej rozpoznawana w początkowym stadium klinicznym i prezentowała klasyczny immunofenotyp. Aberracje chromosomalne występowały u mniejszej liczby pacjentów (27%). Natomiast atypową morfologię komórek B stwierdzono u 90 chorych (23%), którzy mieli zwykle zaawansowaną klinicznie białaczkę z aberrentnym immunofenotypem. Zaburzenia kariotypu wystąpiły w tej grupie u większości chorych (55%). Przeżycie tych pacjentów było znacząco krótsze [6]. Podobne wyniki uzyskali w swoich badaniach Melo i Vallespi [7,8]. Obecnie wiadomo już, że atypowa morfologia limfocytów związana jest także z niekorzystnymi rokowniczo zaburzeniami chromosomów jak: trisomia 12, delecja 11q22-23 oraz delecja 17p13. Częściej występuje u chorych ze szczególnie źle rokującym podtypem PBL wywodzącym się z niezmutowanych komórek B (brak mutacji genu IgV H ) [9,10]. Antygen CD38 jest niezależnym czynnikiem rokowniczym i według większości autorów oznaczenie jego ekspresji na komórkach B powinno być rutynowo stosowane dla identyfikacji pacjentów z wysokim ryzykiem progresji PBL. Ekspresja CD38 na powierzchni limfocytów jest związana z krótszym całkowitym przeżyciem i krótszym przeżyciem wolnym od progresji oraz z gorszą odpowiedzią na leczenie PBL. Wykazuje związek z nieobecnością mutacji genu IgV H, jak również występowaniem białka ZAP-70 [11,12]. W dobie fascynacji metodami genetycznymi postanowiliśmy zwrócić uwagę na nieco niedoceniany i zapomniany parametr jakim jest morfologia limfocytów PBL. W naszym badaniu atypowe limfocyty występowały zdecydowanie częściej w grupie pacjentów CD38 pozytywnych. Ponadto stosując rutynową ocenę morfologiczną i posługując się podstawowymi parametrami morfometrycznymi wykazaliśmy obiektywne statystycznie znamienne różnice pomiędzy klasycznymi i atypowymi formami komórek B. PODSUMOWANIE Atypowe limfocyty w PBL są ważnym czynnikiem rokowniczym nawet w mało zaawansowanej klinicznie chorobie i jedynym, który nie wymaga dodatkowych badań oraz nie pociąga kosztów. Posługując

5 18 S. Chełstowska i wsp.: Atypowa morfologia limfocytów: niekorzystny rokowniczo czynnik się kryteriami FAB, można w prosty i jednoznaczny sposób wyodrębnić grupę pacjentów wysokiego ryzyka. Atypowa morfologia komórek B pozostaje w ścisłym związku z innymi źle rokującymi czynnikami, także tymi poznanymi stosunkowo niedawno, jak antygen CD38, białko ZAP-70 i stan mutacyjny genu IgV H. PIŚMIENNICTWO 1. Robak T.: Czynniki prognostyczne w przewlekłej białaczce limfatycznej. Acta Haematol. Pol., 2003; 34 (4): Szemraj Z., Jamroziak K., Robak T.: Antygen CD38 jako czynnik prognostyczny w B-komórkowej przewlekłej białaczce limfocytowej. Acta Haematol. Pol., 2007; 38 (2): Matutes E., Polliack A.: Morphological and immunophenotypic features of chronić lymphocytic leukemia. Rev. Clin. Exp. Hematol., 2000; 4 (1): Wołowiec D.: Czynniki rokownicze i predykcyjne w przewlekłej białaczce limfocytowej. Acta Haematol. Pol., 2009; 40 (2): Mauro F., Gentile M., Mancini F. et al.: Prognostic significance of lymphocyte morphology in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia treated with first line therapy of fludarabine + prednisone. Haematologica, 2002; 87 (6): Criel A., Verhoef G., Vlietinck R. et al.: Further characterisation of morphologically defined typical and atypical CLL: a clinical, immunophenotypic, cytogenetic and prognostic study on 390 cases. Br. J. Haematol., 1997; 97: Oscier D., Matutes E., Copplestone A. et al.: Atypical lymphocyte morphology: an adverse prognostic factor for disease progression in stage A CLL independent of trisomy 12. Br. J. Haematol., 1997; 98: D Arena G., Dell'Olio M., Musto P. et al.: Morphologically typical and atypical B-cell chronić lymphocytic leukemias display a different pattern of surface antigenic density. Leukemia and Lymphoma, 2001; 42 (4): Yin C., Lin K., Ketterling R. et al.: Chronic lymphocytic leukemia with t(2;14)(p16;q32) involves the BCL11A and IgH genes and is associated with atypical morphologic features and unmutated IgVH genes. Am. J. Clin. Pathol., 2009; 131: Matutes E., Attygalle A., Wotherspoon A. et al.: Diagnostic issues in chronic lymphocytic leukemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2010; 23: Mainou-Fowler T., Dignum H., Proctor S. et al.: The prognostic value of CD38 expression and its quantification in B cel chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma, 2004; 45 (3): D Arena G., Musto P., Cascavilla N. et al.: CD38 expression correlates with adverse biological features and predicts poor clinical outcome in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma, 2001; 42 (1-2): Adres do korespondencji: Sylwia Chełstowska ul. Garibaldiego 4/ Warszawa tel schelstowska@wim.mil.pl