Maria Szczotka ROZPRAWA HABILITACYJNA

Transkrypt

1 Maria Szczotka ZASTOSOWANIE CYTOMETRII PRZEPŁYWOWEJ DO OCENY EKSPRESJI BIAŁKA gp51 WIRUSA ENZOOTYCZNEJ BIAŁACZKI BYDŁA (BLV) W LIMFOCYTACH ZAKAŻONYCH ZWIERZĄT ROZPRAWA HABILITACYJNA RECENZENCI: prof. dr hab. Krzysztof Kostro z Katedry Epizootiologii i Kliniki Chorób Zakaźnych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Akademii Rolniczej w Lublinie prof. dr hab. Jacek Roszkowski, emerytowany profesor z Państwowego Instytutu Weterynaryjnego-Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach prof. dr hab. Janusz A. Madej z Katedry Anatomii Patologicznej, Fizjopatologii i Weterynarii Sądowej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu prof. dr hab. Józef Szarek z Zespołu Weterynarii Sądowej i Administracji Weterynaryjnej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego w Olsztynie

2 STRESZCZENIE Enzootyczna białaczka bydła jest chorobą zakaźną, którą wywołuje limfotropowy wirus białaczki bydła Bovine Leukemia Virus (BLV), należący do rodziny Retroviridae, rodzaj Deltaretrovirus. Po wniknięciu wirusa do organizmu na powierzchni limfocytów następuje ekspresja białek wirusowych, głównie glikoproteiny gp51. Przeciwko niej wytwarzane są przeciwciała wykrywane jako pierwsze w badaniach serologicznych. Czasami zakażenie wirusem ma charakter latentny, co oznacza, że wirus jest obecny w zakażonym organizmie, ale nie wywołuje widocznych objawów klinicznych. Stosowane metody serologiczne nie wykrywają wszystkich zakażonych zwierząt, gdyż w początkowym etapie zakażenia poziom przeciwciał jest niski, często poniżej granicy wykrywalności użytego systemu badawczego. U niektórych zwierząt układ immunologiczny słabo reaguje na zakażenie i poziom wytwarzanych przeciwciał przeciw BLV jest zbyt niski. Zwierzęta zakażone, ale seronegatywne, stanowią rezerwuar wirusa i będąc siewcami wirusa stanowią zagrożenie dla innych zwierząt. Podjęte badania miały na celu analizę metodą cytometrii przepływowej obecności gp51 w limfocytach krwi i komórkach izolowanych z narządów ze zmianami o charakterze proliferacyjnym owiec doświadczalnie zakażonych BLV oraz w komórkach krwi i mleka bydła białaczkowego. Określono również charakter limfocytozy oraz rodzaj komórek obecnych w guzach nowotworowych. Obecność gp51 w limfocytach stwierdzono w limfocytach krwi już po 14 dniach od zakażenia. Zaobserwowano wzrost liczby limfocytów z ekspresją gp51 wraz z progresją choroby. Szczególnie silnie wyrażoną ekspresję stwierdzono w nowotworowych zmianach w węzłach chłonnych i narządach wewnętrznych. Wykazano także obecność gp51 w komórkach krwi i mleka u bydła, jednak ekspresja gp51 w mleku była znacznie słabiej wyrażona. Wysokie limfocytozy charakteryzowały się obecnością młodocianych form limfocytów z markerem CD19+ oraz IgM+CD19+, co potwierdzało B-komórkowy charakter limfocytoz. W guzach

3 białaczkowych także stwierdzono obecność limfocytów B. Stwierdzono, że u zwierząt z chłoniakiem odsetek limfocytów CD4+ zmniejszał się, zwiększał się natomiast odsetek limfocytów CD8+, co powodowało obniżenie wartości liczbowej stosunku CD4:CD8. Świadczyło to o progresji choroby i o niekorzystnym rokowaniu, analogicznie jak w przypadku chłoniaków u ludzi. Metodą immunofluorescencji z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych anty gp51 wykazano obecność gp51 w limfocytach krwi i mleka bydła oraz limfocytach i guzach nowotworowych u owiec. Badania testem PCR i nested-pcr wykazały obecność prowirusowego DNA we krwi i narządach wewnętrznych, a zastosowanie PCR in situ pozwoliło na stwierdzenie produktów PCR w komórkach narządów wewnętrznych ze zmianami guzowatymi. U zwierząt zakażonych zaobserwowano wyższy odsetek komórek wykazujących obecność cykliny PCNA oraz przeciwdziałającego apoptozie białka bcl-2. Zastosowana metoda cytometrii przepływowej pozwoliła na wczesne wykrycie ekspresji gp51 w limfocytach krwi owiec, zanim w surowicy pojawiły się przeciwciała wykrywalne testem ELISA. Umożliwiło to poznanie dynamiki rozwoju zakażenia owiec BLV, monitorowanie wpływu wirusa na układ immunologiczny oraz określenie rodzaju limfocytów związanych z limfocytozami i zmianami o charakterze nowotworowym w narządach wewnętrznych.

4 SUMMARY Enzootic bovine leukemia is an enzootic disease caused by a lymphotropic Bovine Leukemia Virus (BLV) that belongs to Retroviridae family, genus Deltaretroviridae. In infected organism viral proteins, mostly glycoprotein gp51, are expressed on the surface of lymphocytes. The first antibodies that can be detected in serological tests are directed against gp51. Sometimes BLV infection is latent and no clinical signs are observed. Commonly used serological methods do not detect all the infected animals because at the first stage of infection the level of antibodies is low, in many cases below the detection limit. In some animals immunological system reacts weakly after infection and the level of BLV antibodies is low. The infected seronegative animals are the reservoir of the virus and can be a hazard for other animals. The aim of the study was to analyse the presence of gp51 in blood lymphocytes and cells isolated from organs with lymphoproliferative changes using flow cytometry method. The material was obtained from sheep experimentally infected with BLV, and blood and milk lymphocytes from BLV-positive cattle. The character of lymphocytosis and the type of cells present in neoplasmatic tumours were also determined. The presence of gp51 in lymphocytes was detected as early as 14 days after the infection. The increase in the number of lymphocytes with gp51 expression was observed in paralel with the progression of the disease. The significantly high expression was observed in neoplasmatic lymph nodes and inner organs. The presence of gp51 was also detected in blood and in milk lymphocytes of cattle, but the expression in milk was weaker. The high lymphocytoses were characterised by the presence of immature forms of lymphocytes with CD19+ and IgM+CD19+ markers which confirmed the B-cells type of lymphocytoses. The B cells were observed in leukemic tumours. It was also noted that in animals with lymphoma the percentage of CD4+ decreased and the percentage of CD8+ lymhocytes increased

5 which decreased the ratio of CD4 to CD8. It proved the progress of the disease and negative prognosis, like in cases of human lymphomas. The presence of gp51 in lymphocytes of blood and milk as well as in lymphocytes and tumours of neoplasmatic sheep was detected using immunofluorescence method with monoclonal gp51 antibodies. With the use of PCR and nested-pcr the presence of proviral DNA in blood and internal organs was detected. The use of in situ PCR enabled to detect PCR products in cells of internal organs with tumour lesions. In infected animals higher percentage of cells with the presence of PCNA cycline and bcl-2 protein protecting against apoptosis were identified The flow cytometry method used in the study enabled to detect gp51 expression in sheep blood lymphocytes at the early stages of the infection, before it was possible to detect the antibodies in serum using the ELISA. The study enabled to understand the dynamics of BLV infection in sheep and the modulation of immunological system by the virus. It was also possible to evaluate the type of lymphocytes related to lymphocytoses and neoplasmatic lesions in the internal organs.

6