Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Artura Zajkowicza

Transkrypt

1 dr hab. Beata Schlichtholz Gdańsk, 20 października 2015 r. Katedra i Zakład Biochemii Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki Gdańsk Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Artura Zajkowicza pt. Właściwości szlaku sygnalizacyjnego białka p53 ujawnione podczas analizy skutków traktowania komórek resweratrolem Przedmiotem recenzji jest praca doktorska mgr inż. Artura Zajkowicza zrealizowana w Centrum Onkologii Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach pod kierownictwem Pana dr hab. Marka Rusina. Ocena pracy doktorskiej została wykonana w oparciu o cykl czterech prac oryginalnych uzupełnionych o przygotowane przez Doktoranta streszczenie w języku polskim i angielskim, opis celów oraz streszczenie prac eksperymentalnych wraz z podsumowaniem i wnioskami. Artykuły naukowe, które są podstawą recenzowanej pracy to: 1. Rusin M, Zajkowicz A, Butkiewicz D. Resveratrol induces senescence-like growth inhibition of U-2 OS cells associated with the instability of telomeric DNA and upregulation of BRCA1. Mech Ageing Dev. 2009; 130(8): Zajkowicz A, Rusin M. The activation of the p53 pathway by the AMP mimetic AICAR is reduced by inhibitors of the ATM or mtor kinases. Mech Ageing Dev. 2011;132(11-12): Zajkowicz A, Krześniak M, Matuszczyk I, Głowala-Kosińska M, Butkiewicz D, Rusin M. Nutlin-3a, an MDM2 antagonist and p53 activator, helps to preserve the replicative potential of cancer cells treated with a genotoxic dose of resveratrol. Mol Biol Rep. 2013;40(8): Zajkowicz A, Butkiewicz D, Drosik A, Giglok M, Suwiński R, Rusin M. Truncating mutations of PPM1D are found in blood DNA samples of lung cancer patients. Br J Cancer Mar 17;112(6): Wszystkie artykuły zostały opublikowane w prestiżowych czasopismach z listy filadelfijskiej o wysokim współczynniku oddziaływania IF (Mechanisms of Aging and Development IF = 4,8 w

2 roku 2009 i 3,4 w roku 2011; Molecular Biology Reports IF = 1,95 w roku 2013; British Journal of Cancer IF = 4,8 w roku 2014). Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że mgr inż. Artur Zajkowicz jest w trzech publikacjach pierwszym autorem a w jednej drugim co jednoznacznie wskazuje na znaczący udział Doktoranta w planowaniu i realizacji przedstawionych badań naukowych oraz analizie danych i przygotowaniu manuskryptów do druku. Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska wpisuje się w nurt badań, których celem jest określenie miejsca i mechanizmu działania polifenoli stilbenowych pochodzenia naturalnego o kardioprotekcyjnych, antyoksydacyjnych, przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych właściwościach. Autor i współpracujący z nim zespół postawili przed sobą bardzo ważne zadanie zweryfikowania wpływu resweratrolu na właściwości szlaku zależnego od białka p53. Tematyka podjętych padań jest bardzo aktualna i istotna. Utrata funkcji supresorowej białka p53 jest zjawiskiem powszechnie obserwowanym w chorobach nowotworowych. Uszkodzenia DNA, stres oksydacyjny i onkogenny prowadzą do aktywacji tego negatywnego regulatora cyklu komórkowego, który w zależności od rodzaju komórki i czynników środowiskowy może indukować naprawę DNA, apoptozę lub prowadzić do starzenia komórkowego. Białko p53 odgrywa również istotną rolę w regulacji metabolizmu energetycznego komórki poprzez spowolnienie glikolizy oraz promocję fosforylacji oksydacyjnej. Zastosowanie naturalnych związków chemicznych mogących regulować szlak sygnałowy zależny od białka p53 w celu zahamowania, opóźnienia lub odwrócenia procesu nowotworzenia od lat wzbudza duże zainteresowanie. Podjęty przez Doktoranta problem badawczy dotyczy mechanizmów regulacji szlaku sygnalizacyjnego zależnego od białka p53 w komórkach nowotworowych. W swojej pracy mgr inż. Artur Zajkowicz skoncentrował się na poszukiwaniu przyczyn zróżnicowanego stopnia aktywacji szlaku p53 w komórkach nowotworowych linii U-2 OS i A549 traktowanych resweratrolem oraz określeniu biologicznych następstw tego traktowania. Postawił hipotezę, że wiele właściwości resweratrolu może wynikać z jego zdolności do generowania stresu replikacyjnego i aktywacji p53. W pierwszym etapie badań Doktorant wykazał, że resweratrol w stężeniu 50 µm równie silnie blokował proliferację obu linii komórkowych. Następnie z zastosowaniem cytometrii przepływowej określił fazę cyklu komórkowego, w której resweratrol hamował podziały komórkowe. Za pomocą techniki immunoblotingu określił profil ekspresji białek związanych z kontrolą cyklu komórkowego i wykazał, że komórki linii A549 mają odmienny profil ekspresji białek w porównaniu z komórkami linii U-2 OS. Długotrwała inkubacja komórek z resweratrolem była związana z podwyższonym poziomem

3 ufosforylowanego białka p53 w obu liniach komórkowy, aczkolwiek akumulacja białka p21, zanik ekspresji cykliny B1 i białka BRCA1 oraz niski poziom fosforylacji białka RB był obserwowany tylko w komórkach linii A549. Doktorant wykonał także analizę markerów morfologicznych i biochemicznych komórek ulegających starzeniu. Zaobserwowana aktywność SA- β-galaktozydazy potwierdziła, że resweratrol indukował starzenie komórkowe, a test na klonogenność wykazał, że komórki utraciły potencjał replikacyjny. Autor mając na uwadze fakt, że przyspieszone starzenie komórkowe może być indukowane uszkodzeniem DNA, wykonał także analizę immunocytochemiczną histonu γh2ax będącego znacznikiem uszkodzeń DNA. Uzyskane wyniki wskazują, że resweratrol aktywuje szlak odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Doktorant wykazał, że resweratrol może indukować stres replikacyjny i prowadzić do starzenia komórkowego niezależnie od stopnia aktywacji szlaku sygnalizacyjnego zależnego od białka p53. Kolejne ważne zagadnienie badawcze będące przedmiotem rozprawy doktorskiej mgr inż. Artura Zajkowicza dotyczy aktywacji białka p53 przez stres metaboliczny, w którym mediatorem jest kinaza białkowa aktywowana przez AMP (AMPK). Celem przeprowadzonych badań było porównanie mechanizmu aktywacji białka p53 przez resweratrol z mechanizmem indukowanym przez nukleotyd purynowy AICAR (rybonukleotyd 5-aminoimidazolo-4- karboksyamidu) będący analogiem AMP. Genotoksyczność badanych związków była określona w oparciu o ocenę fosforylacji histonu H2AX oraz fosforylacji reszty serynowej S1981 kinazy ATM. Analiza wpływu inhibitora kinazy ATM o nazwie Ku oraz rapamycyny będącej inhibitorem kinazy mtor na aktywację białka p53 wywołaną zarówno przez resweratrol, jak i AICAR wykazała, że ATM i mtor biorą udział w aktywacji szlaku p53 w komórkach linii A549 a kinaza ATM może być aktywowana poprzez stres metaboliczny. Wyniki pierwszych badań były impulsem do przeprowadzenia kolejnych analiz mających na celu poznanie przyczyn obniżonej aktywności szlaku sygnałowego zależnego od p53 w komórkach U-2 OS traktowanych resweratrolem. Doktorant posługując się techniką PCR w czasie rzeczywistym oraz immunodetekcją wykazał, że w komórkach traktowanych resweratrolem dochodzi do obniżenia ekspresji p21 i MDM2 zarówno na poziomie mrna, jak i białka. W swoich badaniach nie zaobserwował istotnych różnic we wzorze modyfikacji potranslacyjnych białka p53 w komórkach U-2 OS w porównaniu do komórek A549 a dalsze badania wykazały, że nutlina-3a, inhibitor białka MDM2 i tym samym regulator aktywność białka p53, osłabia indukowaną resweratrolem aktywację szlaku odpowiedzi na uszkodzenia

4 DNA oraz pomaga zachować potencjał replikacyjny komórek traktowanych badanym polifenolem. Kolejny problem podjęty w pracy doktorskiej mgr inż. Artura Zajkowicza dotyczył wpływu podwyższonego poziomu fosfatazy WIP1 na szlak zależny od białka p53. Zastosowanie shrna wyciszających ekspresję genu PPM1D kodującego białko WIP1 w komórkach U-2 OS traktowanych resweratrolem pozwoliło zaobserwować, że podwyższona ekspresja białka WIP1 obniża aktywację białka p53. Niewątpliwie ważnym osiągnięciem Doktoranta jest identyfikacja nonsensownej mutacji w genie PPM1D (Arg458STOP), która prowadzi do powstania skróconej o ok. 25% formy białka WIP1, negatywnie regulującej aktywację białka p53 w komórkach U-2 OS. Ten zaskakujący, ale jakże ciekawy wynik inicjuje kolejne badania, których celem była funkcjonalna analiza nowo odkrytej mutacji w genie PPM1D oraz określenie częstości występowania mutacji u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc. Posługując się skonstruowanymi przez siebie wektorami ekspresyjnymi oraz podwójnym testem lucyferazowym Doktorant nie zaobserwował, aby badane przez niego formy WIP1 modulowały zdolność p53 do aktywacji transkrypcji genów. Swoimi badaniami potwierdził, ze mutant WIP1 wykryty w komórkach U-2 OS koduje białko o zwiększonej stabilności, silnie akumulujące się w komórce i mające zdolność defosforylacji białka p53. Analiza DNA pochodzącego od 543 pacjentów z rakiem płuca wykazała obecność mutacji tylko u około 1% pacjentów. Wyniki badań mgr inż. Artura Zajkowicza prezentują wysoki poziom naukowy i wnoszą znaczący wkład w badania, których celem jest poznanie mechanizmów regulacji szlaku sygnalizacyjnego zależnego od białka p53 w komórkach nowotworowych. Doniosłość celów badawczych została doceniona między innymi przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Narodowe Centrum Nauki, które sfinansowały część badań. Sam fakt, że rozprawa doktorska powstała na podstawie czterech prac, które pomyślnie przeszły proces recenzji i zostały opublikowane w czasopismach znajdujących się na liście filadelfijskiej, nie pozostawia wątpliwości, co do wartości i oryginalności problemu badawczego podjętego w rozprawie. Wstępy publikacji w sposób jasny przedstawiają problem badawczy oraz uzasadniają konieczność badań w oparciu o dobrze dobrane przez Doktoranta źródła literaturowe. Doktorant wykazał się znajomością wielu technik biologii molekularnych i umiejętnością ich właściwego doboru do realizacji celów badawczych. Interpretacja wyników dowodzi dojrzałości Doktoranta i jego szerokiej wiedzy. Dokumentacja w wymienionych publikacjach składa się z wysokiej jakości kolorowych fotografii, schematów oraz dobrze zorganizowanych tabel i wykresów,

5