Nr kat. EM02 Wersja: 1.2018 Zestaw do izolacji genomowego DNA z bakterii EXTRACTME jest zarejestrowanym znakiem towarowym BLIRT S.A.
www.blirt.eu
Nr kat. EM02 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BACTERIA KIT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji bakteryjnego DNA o wysokiej czystości z hodowli płynnych i powierzchniowych oraz osadów mrożonych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI 1 Warunki prze chowywania Nr katalogowy EM02-010 EM02-050 EM02-250 BacL Buffer (Lysis Buffer) 3 ml 15 ml 75 ml TP RNase A * (lyophilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 2 RNase Buffer 100 μl 220 μl 1.1 ml TP Proteinase K ** (lyophilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 3 Proteinase Buffer 200 μl 940 μl 4.7 ml TP BacB Buffer (Binding Buffer) 3.5 ml 18 ml 88 ml TP BacW Buffer (Wash Buffer) 10 ml 50 ml 250 ml TP Elution Buffer 2 ml 10 ml 5 x 10 ml TP DNA Purification Columns 10 szt. 50 szt. 5 x 50 szt. TP Collection Tubes (2 ml) 10 szt. 50 szt. 5 x 50 szt. TP 1 TP temperatura pokojowa (+15 C do +25 C) 2 RNase A w roztworze przechowywana w temperaturze +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeżeli wymagane jest przechowywanie RNase A przez dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNase A i przechowywanie w temperaturze -20 C. 3 Roztwór Proteinase K należy przechowywać w temperaturze -20 C. * Przed pierwszym użyciem do probówki zawierające liofilizat RNase A należy dodać 220 μl RNase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 100 μl buforu). ** Do probówki zawierającej liofilizat Proteinase K należy dodać 940 μl Proteinase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 200 μl buforu). 3
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Data ważności Data ważności zestawu, przechowywanego w odpowiednich warunkach, podana jest na etykietach produktu. Po otwarciu zestaw zachowuje stabilność przez okres 12 miesięcy. III. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Bakteryjna hodowla płynna lub powierzchniowa, bądź mrożony osad bakteryjny. WYDAJNOŚĆ IZOLACJI Liczba komórek: 5 x 10 8 100% Liczba komórek: 1 x 10 9 3 x 10 9 75 9 0 % (wg protokołu izolacji DNA z dużej ilości komórek) Liczba komórek: 1 x 10 9 3 x 10 9 60% (wg protokołu standardowego) POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 40 μg DNA CZAS IZOLACJI ok. 40 60 minut (włączając czas inkubacji) CZYSTOŚĆ DNA A 260/A280 = 1.7 1.9 www.blirt.eu 4
Nr kat. EM02 IV. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Izolacja DNA z hodowli płynnej (0.2 3 ml) Przed pobraniem odpowiedniej objętości hodowli płynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do 1.5 ml probówki typu Eppendorf przenieść żądaną objętość hodowli bakteryjnej (maksymalnie 1.5 ml) i wirować przy 3000 4000 x g. Zdekantować supernatant. Jeśli istnieje potrzeba izolacji z większej niż 1.5 ml objętości hodowli, do powstałego osadu dodać kolejne 1.5 ml hodowli i powtórzyć wirowanie. Kontynuować izolację od pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). Izolacja DNA z dużej liczby komórek W przypadku izolacji DNA z dużej liczby komórek ( 10 9 ), powstały po zwirowaniu osad należy dokładnie zawiesić w 450 μl BacL Buffer oraz zwiększyć ilości dodawanych enzymów odpowiednio do 6 μl w przypadku RNase A (pkt. 3) oraz 15 μl w przypadku Proteinase K (pkt. 5 Protokołu izolacji, sekcja VI). Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad należy bezzwłocznie zawiesić w 300 μl BacL Buffer. Nie należy doprowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Izolacja DNA z hodowli powierzchniowej Do probówki 1.5 ml typu Eppendorf przenieść 300 μl BacL Buffer. Ezą pobrać obfitą liczbę komórek z podłoża na płytce Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Izolacja z bakterii Gram-dodatnich Przed przystąpieniem do izolacji DNA z bakterii Gram-dodatnich próbkę należy poddać działaniu odpowiedniego enzymu. Do izolacji DNA z bakterii z rodzaju Staphylococcus zaleca się stosowanie lizostafyny, a w przypadku bakterii z rodzaju Enterococcus lizozymu. 5
Staphylococcus: 1. Odwirować 1.5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** (dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 30 μl *** roztworu lizostafyny 400 U/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować 20 60 minut *** w temp. 37 C. 5. Dodać 300 μl BacL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać przez worteksowanie. 6. Kontynuować izolację od pkt. 6 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). * W przypadku gęstych hodowli, izolację należy prowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. ** Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0. *** W przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych należy dodać 50 μl preparatu lizostafyny i inkubować 1 godzinę w temp. 37 C. Enterococcus: 1. Odwirować 1.5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** (dokładnie rozpipetować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 40 μl roztworu lizozymu 100 mg/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować 40 60 minut w 37 C. 5. Dodać 300 μl BacL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać. 6. Kontynuować izolację od pkt. 6 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). * W przypadku gęstych hodowli, izolację należy prowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. ** Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0. www.blirt.eu 6
Nr kat. EM02 V. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz liofilizatu RNase A w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temperatury 50 60 C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temperatury 37 C i 55 C. 5. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej. 7
VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Zwirować 0.2 1.5 ml hodowli bakteryjnej przy 3000 4000 x g przez 5 min. c Można użyć większej objętości hodowli bakteryjnej. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IV. Przygotowanie próbki. 2. S u p e r n a t a n t z d e k a n t o w a ć, a o s a d b a k t e r y j n y d o k ł a d n i e zawiesić w 300 μl BacL Buffer. 3. Dodać 4 μl RNase A i wymieszać przez worteksowanie. 4. Inkubować 10 min w temp. 37 C. 5. Dodać 10 μl Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie. 6. Inkubować 10 min w temp. 55 C. 7. Dodać 350 μl BacB Buffer i dokładnie wymieszać. 8. Inkubować kolejne 5 min w temp. 55 C. 9. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 s. 10. Wirować 120 s przy 11 000 15 000 x g. 11. Nie naruszając osadu delikatnie przenieść supernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 60 s przy 11 000 15 000 x g. 12. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej. 13. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego BacW Buffer i wirować 30 s przy 11 000 15 000 x g. www.blirt.eu 8
Nr kat. EM02 14. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. 15. Dodać do minikolumny 400 μl BacW Buffer i wirować 30 s przy 11 000 15 000 x g. 16. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. 17. Wirować 60 120 s przy 15 000 21 000 x g. c Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 18. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1.5 ml typu Eppendorf. 19. Nanieść 50 100 μl Elution Buffer centralnie na złoże w minikolumnie. c Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20-200 μl. 20. Inkubować minikolumnę z buforem przez 120 s. 21. Wirować 60 s przy 11 000 15 000 x g. 22. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temperaturze +4 C lub -20 C w zależności od dalszych analiz. 9
VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Proteinase K (lyophilized) Niebezpieczeństwo H334, H315, H319, H335 P261, P271, P342+P311, P304+P340 BacB Buffer Niebezpieczeństwo H318, H315,H412 P264, P280, P305+P351+P338 P310 BacW Buffer Niebezpieczeństwo H225, H319, H336 P210, P264, P370+P378, 304+P340 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić. P261 Unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy. P264 Dokładnie umyć ręce po użyciu. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P305+P351+P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P310 Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P304+P340 W przypadku dostania się do dróg oddechowych: wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. P370+P378 W przypadku pożaru użyć: CO 2, proszek gaśniczy lub strumień wody; większy pożar zwalczać strumieniem wody lub pianą odporną na działanie alkoholu. www.blirt.eu 10
11 Nr kat. EM02
www.blirt.eu