LABORATORIUM 3 Filtracja żelowa preparatu oksydazy polifenolowej (PPO) oczyszczanego w procesie wysalania siarczanem amonu z wykorzystaniem złoża Sephadex G-50 CEL ĆWICZENIA: Zapoznanie się z przykładową procedurą odsalania oczyszczanych preparatów enzymatycznych w procesie klasycznej filtracji żelowej. MATERIAŁY - wysolony preparat tyrozynazy (V~3 4 ml); - złoże chromatograficzne do filtracji żelowej Sephadex G-50 (~ 50 ml upakowane w kolumnie i kondycjonowane 0,0 M buforem fosforanowym ph 7,0); - spektrofotometr; - 0, M bufor fosforanowy ph 7.0 - eluent; - 0, M NaOH, 0, M HCl, 2 M NaCl do regeneracji złoża chromatograficznego; - mm L-Tyrozyna w 0, M buforze fosforanowym ph 7.0; - odczynnik Lowry ego i Folina. PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA UWAGA!!! Z roztworu wyjściowego enzymu, (frakcja 0 wyjściowa) pobrać próbkę do pomiarów absorbancji przy 280, aktywności enzymatycznej i stężenia białka metodą Lowry ego (ok. ml).. Przed ćwiczeniami 50 ml nośnika Sephadex G-50 kondycjonować w 0,0 M buforze fosforanowym ph 7, a następnie upakować w kolumnie (wykonuje prowadzący przed zajęciami). 2. Doświadczenie rozpocząć od naniesienia na szczyt kolumny, 2 ml wysolonego preparatu enzymu (frakcja 0, wyjściowa) (przy otwartym wylocie z kolumny). Gdy czoło próbki osiągnie poziom złoża, należy zamknąć wylot z kolumny, pozostawić tak przygotowane złoże na chwilę i w tym samym czasie na jego szczyt wprowadzić delikatnie eluent (0, M bufor fosforanowy ph 7.0). 3. Następnie otworzyć wylot z kolumny, włączyć stoper i przy ustalonym przepływie (ok. 0,3 0,4 ml. min - ) 0, M buforu fosforanowego (eluent) przez złoże zbierać frakcje o objętości 2 ml i równocześnie zapisywać czas zebrania każdej frakcji. 4. Ponadto, na bieżąco, w każdej frakcji należy mierzyć absorbancję przy 280 nm (kuweta kwarcowa), względem 0, M buforu fosforanowego o ph 7.0 jako próbki zerowej w celu oszacowania ilości białka w badanych próbkach, a następnie zlać powrotem do probówki i pozostawić do dalszych analiz.
5. Gdy absorbancja frakcji przy 280 nm osiągnie wartość bliską zeru przerwać proces wymywania i rozpocząć procedurę odmywania kolumny zgodnie z procedurą umieszczoną w Tabeli. Tabela. Procedura odmywania kolumny po procesie chromatografii ROZTWÓR ILOŚĆ [ml] woda destylowana 00 0,0 M NaCl 50 Woda destylowana 00 0,0 M bufor fosforanowy ph 7.0 00 UWAGA!!! ANALIZY NA AKTYWNOŚĆ ENZYMATYCZNĄ I STĘŻENIE BIAŁKA (Lowry). Dla wszystkich fakcji należy obligatoryjnie wykonać pomiary absorbancji przy 280 nm. 2. Natomiast aktywność enzymatyczną względem mm L-Tyrozyny oraz stężenie białka metodą Lowry ego tylko dla frakcji charakteryzujących się znaczącą Abs280!!!! (W celu ustalenia próbek do analiz skonsultować się z prowadzącą ćwiczenia). UWAGI TECHNICZNE. Pamiętać o odpowiednich rozcieńczeniach próbek do pomiarów zarówno aktywności i stężenia białka. Na arkuszu wyników podano przykładowe rozcieńczenia dla wyjściowego preparatu enzymu, ale kolejnie należy ustalić intuicyjnie ogólna zasada tam gdzie wysoka wartość A280 tym więcej białka i potencjalnie więcej enzymu. 2. Przy pomiarach aktywności dla frakcji mniej aktywnych może się tak zdarzyć, że jakikolwiek przyrost absorbancji (A475) w czasie będzie zauważalny dopiero po upływie 5-8 minut, dlatego dla pewności taki pomiar proszę wykonywać przynajmniej 5 minut, tak aby mieć chociaż 5-6 punktów do wyznaczenia aktywności. 3. Pomiar stężenia białka i aktywności enzymatycznej we frakcjach najbardziej aktywnych oraz w wyjściowym roztworze enzymu wykonać w przynajmniej dwóch powtórzeniach. 4. Natomiast w pozostałych wybranych frakcjach pomiary te należy wykonać tylko w jednym powtórzeniu. 5. Pomiary aktywności w wybranych frakcjach można wykonywać w miarę na bieżąco jeszcze w trakcie trwania chromatografii (będzie dostęp do drugiego spektrofotometru), natomiast pomiar stężenia białka metodą Lowry ego należy wykonać dopiero po zakończeniu procesu filtracji żelowej w jednej serii dla wszystkich wybranych frakcji!!! 2
6. W celu szybszej weryfikacji otrzymanych wyników eksperymentalnych, proszę o przyniesienie laptopa na każdą podgrupę!!!! 7. Przed zajęciami można przygotować plik Exel zgodnie z podanym w instrukcji arkuszem wyników. 8. Czas trwania procesu chromatografii od nałożenia próbki na szczyt kolumny do uzyskania ostatniej frakcji zgodnie z przeprowadzonym eksperymentem testowym wynosi ok. 2,5 h. Procedura pomiaru białka metodą Lowry ego ok. h (50 min test + 0 min na pomiar A750). 9. Odmywanie kolumny powinno zostać rozpoczęte na zajęciach, a potem zajmuje się tym prowadzący/a zajęcia. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Pomiar aktywności enzymu natywnego prowadzić w temperaturze pokojowej, w 0, M buforze fosforanowym o ph 7,0 i w obecności mm L-Tyrozyny lub L-DOPA jako substratu. W procedurze standardowej do,0 ml substratu dodać 00 μl roztworu enzymu, szybko zmieszać i przenieść do kuwety. Następnie przy użyciu spektrofotometru UV/Vis monitorować zmiany absorbancji w czasie przy długości fali λ= 475 nm. Przed pomiarami aparat wyzerować na roztwór substratu. Aktywność enzymu wyrazić liczbą jednostek aktywności w ml roztworu tyrozynazy według wzoru: 000 Aktywność min ml U ml A 000 t 475 nm V V gdzie: ΔA 475nm zmiana absorbancji w czasie Δt, w liniowym zakresie pomiaru przy długości fali 475 nm [min - ]; V R całkowita objętość analizowanego roztworu (, ml) [ml]; V E objętość enzymu użytego w pomiarach (0, ml) [ml]. R E () OZNACZANIE STĘŻENIA BIAŁKA Ilość białka w badanych preparatach tyrozynazy oznaczano metodą Lowry ego [6] przy użyciu testu Sigma 5656. Stężenie białka w badanych próbkach wyznaczano na podstawie krzywej standardowej, wykonanej dla albuminy wołowej w zakresie stężeń od 0 do 400 μg. ml -. Procedura postępowania: - 0.5 ml próbki enzymu odpowiednio rozcieńczonej w wodzie + 0.5 ml odczynnika Lowry ego; - przygotować również próbkę zerową 0.5 ml H 2 O + 0.5 ml odczynnika Lowry ego; - tak przygotowane próbki wymieszać i zostawić na 20 min w temperaturze pokojowej; - po 20 minutach dodać 0,25 ml odczynnika Follina i natychmiast po dodaniu każdą próbkę dokładnie wymieszać!!!! i odstawić na 30 min; 3
- po upływie 30 min od dodania odczynnika Follina zmierzyć Abs próbek przy λ=750 nm; - wynik w [mg. ml - ] obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej: PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW 0, M bufor fosforanowy o ph 7.0 5,28 g KH 2 PO 4 2,9 g Na 2 HPO 4 Dopełnić wodą destylowaną do L mm L-Tyrozyna (M=8,2 g/mol) mm L-DOPA (M=97,9 g/mol) NA KOLEJNEJ STRONIE ARKUSZ WYNIKÓW 4
Nr frak. ARKUSZ WYNIKÓW V f [ml] t [min] Białko (A280) Białko met. Lowry ego mm L-Tyrozyna Rx A280 Rx A750 C białka [mg/ml] 0 wyj. 2 0 5x 20x 5x 2 3 4 5 6 7 8 9 0 2 3 4 5 6 7 8 9 20 2 22 23 24 25 26 27 28 29 30 xr da/min Aktywność [U/mL] 5