Laboratorium 6. Immobilizacja enzymu metodą pułapkowania w matrycy hydrożelowej

Transkrypt

1 Laboratorium 6 Immobilizacja enzymu metodą pułapkowania w matrycy hydrożelowej Prowadzący: dr inż. Karolina Labus 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Enzymy uważane są za niezwykle wydajne katalizatory różnorodnych reakcji, które efektywnie mogą być wykorzystane w różnych dziedzinach, np. w przemyśle chemicznym, kosmetycznym, tekstylnym, spożywczym czy farmaceutycznym, jak również w medycynie, ochronie środowiska oraz rolnictwie. Niemniej jednak w większości przypadków zastosowanie enzymów w skali przemysłowej jest ograniczone z uwagi na kilka głównych czynników: wysokie koszty produkcji preparatów enzymatycznych, niewielka możliwość użycia tego samego preparatu kilkukrotnie oraz znacząca podatność enzymów w formie natywnej (niezwiązanej) na inaktywację w ekstremalnych warunkach procesowych (np. wysoka temperatura, obecność rozpuszczalników organicznych, niskie lub wysokie wartości ph). W związku z powyższym, jednym z największych wyzwań obecnej biotechnologii przemysłowej jest stworzenie takiego biokatalizatora, który działałby perfekcyjnie. Do najważniejszych właściwości charakteryzujących efektywny preparat enzymatyczny należą: wysoka stabilność w warunkach procesowych oraz w warunkach przechowywania, jak również możliwość wielokrotnego wykorzystania lub zastosowanie takiego biokatalizatora w procesie ciągłym. Te założenia można spełnić m. in. poprzez immobilizację enzymu. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW Immobilizacja jest jedną z najpopularniejszych procedur stosowanych w celu efektywnego zwiększenia stabilności enzymów. Termin immobilizowany enzym po raz pierwszy został rekomendowany w 1971 roku przez Katzir-Katchalskiego na Pierwszej Konferencji Inżynierii Enzymatycznej (the First Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, US) i zdefiniowany jako: Enzym unieruchomiony/zamknięty w ściśle określonej przestrzeni, który zachowuje swoje właściwości katalityczne oraz może być zastosowany wielokrotnie lub w procesie ciągłym. 1

2 Ogólnie, metody immobilizacji można podzielić na trzy główne grupy: (1) sieciowanie, (2) pułapkowanie i (3) wiązanie z nośnikiem (Rysunek 1).Wszystkie te procedury umożliwiają uzyskanie preparatów enzymatycznych o zwiększonej stabilności, które mogą być zastosowane wielokrotnie lub w procesie ciągłym. Rysunek 1. Ogólny podział metod immobilizacji enzymów. Metoda sieciowania opiera się na wytworzeniu wielokrotnych wiązań kowalencyjnych pomiędzy poszczególnymi cząsteczkami enzymu w wyniku czego powstaje trójwymiarowa usieciowana struktura. Procesy sieciowania charakteryzują się brakiem znaczącego udziału nośnika w całej procedurze i przeprowadzane są z wykorzystaniem różnych typów czynników sieciujących, np.: (i) związków katalizujących powstawanie wiązań kowalencyjnych bezpośrednio pomiędzy grupami funkcyjnymi enzymu lub difunkcyjnych czynników, które są wprowadzane pomiędzy grupy funkcyjne sieciowanych cząsteczek białka tworząc w rezultacie końcowym pewnego typu mostki łączące. Metoda pułapkowania polega na zatrzymaniu cząsteczek natywnego enzymu w ściśle zdefiniowanej przestrzeni ograniczonej przez nierozpuszczalną, porowatą barierę pochodzenia naturalnego lub syntetycznego (np. sieć polimerowa, półprzepuszczalna membrana). Poprzez taką barierę możliwa jest wymiana reagentów (substratów, produktów i innych składników mieszaniny reakcyjnej) z szybkością związaną z dyfuzją tych związków zachodzącą w obu kierunkach. Wiązanie z nośnikiem jest najbardziej popularną metodą immobilizacji, opierającą się o wiązanie cząsteczek enzymu z powierzchnią nierozpuszczalnego nośnika. W tym przypadku odpowiedni dobór matrycy do immobilizacji oraz typu wiązania jest kluczowe do uzyskania biokatalizatora charakteryzującego się satysfakcjonującą (z przemysłowego punktu widzenia) 2

3 jakością. Szereg różnych materiałów można zastosować jako nośniki do immobilizacji m.in. nieorganiczne, organiczne, pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, jak również materiały hybrydowe. Enzymy mogą być wiązane z wykorzystaniem m.in.: słabych oddziaływań typu van der Waalsa, metali przejściowych, oddziaływań powinowactwa lub trwałych wiązań kowalencyjnych. Niemniej jednak, w praktyce najczęściej stosowaną metodą jest adsorpcja i wiązanie kowalencyjne z wykorzystaniem nośników zawierających szeroką gamę reaktywnych grup funkcyjnych. Każda z wyżej wymienionych metod immobilizacji posiada zarówno zalety jak i wady. Dodatkowo różnią się one pod względem stopnia ingerencji w przestrzenną strukturę unieruchamianego białka oraz jego stabilność w warunkach procesowych. Najważniejsze cechy charakteryzujące poszczególne procedury immobilizacji zebrano w Tabeli 1. Tabela 1. Główne cechy charakteryzujące poszczególne metody immobilizacji enzymów Wiązanie z nośnikiem Cecha Sieciowanie Pułapkowanie Adsorpcja Wiązanie kowalencyjne Wytwarzanie Trudne Umiarkowanie trudne Proste Trudne Aktywność enzymu Umiarkowana Wysoka Niska Wysoka Siła wiązania Mocna Mocna/Umiarkowana a Słaba Mocna Ingerencja w strukturę enzymu Wysoka Niska Niska Wysoka Regeneracja nośnika Niemożliwa Niemożliwa Możliwa Niemożliwa Koszty immobilizacji Wykorzystanie w szerszej skali Umiarkowane Niskie Niskie Wysokie Niewielkie Duże Niewielkie Duże a w zależności od typu matrycy zastosowanego jako nośnik Podstawowym parametrem charakteryzującym efektywność immobilizacji metodą pułapkowania w hydrożelowej matrycy jest wydajność pułapkowania definiowana jako: Do kartkówki obowiązuje materiał umieszczony w instrukcji (zarówno część teoretyczna i praktyczna). 3

4 2. CEL ĆWICZENIA Podczas zajęć zapoznają się Państwo z procedurą otrzymywania immobilizowanych preparatów enzymatycznych metodą pułapkowania. Ogólnie, metoda ta bazuje zatrzymaniu enzymu w sieci trójwymiarowej matrycy polimerowej. W tym przypadku, enzym nie jest bezpośrednio związany z nośnikiem tylko niejako uwięziony w pustych przestrzeniach pomiędzy łańcuchami polimerowymi. W związku z tym wpływ immobilizacji na strukturę oraz specyficzne właściwości katalityczne tak unieruchomionego enzymu jest nieznaczny. 3. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Przygotować 0,1M bufor fosforanowy ph 7.0 (dla całej grupy 1L) 200 ml laktozy o stężeniu 50 g/l przygotować w 0,1Mbuforze fosforanowym o ph 7.0 Odczynnik I (różowy) do pomiaru aktywności enzymu Żelatyna, czynnik sieciujący (mikrobiologiczna transglutaminaza, mtgaza) przygotowywana przez prowadzącego zajęcia Enzym do immobilizacji (roztwory β-galactozydazy o różnym stężeniu przygotowane przez prowadzącego zajęcia) Immobilizacja enzymu (β-galaktozydazy) metodą pułapkowania w żelatynowej matrycy hydrożelowej Przygotować 30 ml 15% w/v roztworu żelatyny w 0.1M buforze fosforanowym ph 7.0, umieścić go w termostatowanym szklanym reaktorze (60 C) i mieszać aż do uzyskania całkowitego rozpuszczenia. Następnie otrzymany roztwór żelatyny schłodzić do 40 C. Następnie, w celu rozpoczęcia procesu sieciowania, schłodzony roztwór żelatyny zmieszać z czynnikiem sieciującym zawierającym β-galaktozydazę w stosunku 2:1 W celu otrzymania 1 cząstki hydrożelowej do probówki należy wprowadzić 1 ml czynnika sieciującego zawierającego β-galaktozydazę, a następnie dodać 2 ml roztworu żelatyny, zamknąć probówkę korkiem i natychmiast zmieszać na worteksie Należy przygotować po 5 cząsteczek hydrożelu dla jednego stężenia immobilizowanego enzymu Każda podgrupa przygotowuje hydrożele z immobilizowanym enzymem dla dwóch stężeń unieruchamianego białka Następnie wszystkie probówki z hydrożelami zostawić w 4 C na 1h Po upływie tego czasu wyjąć hydrożele z probówek używając metalowej szpatułki i zostawić do pomiarów aktywności 4

5 3.2. Pomiar aktywności katalitycznej enzymu (przypomnienie analityki z Lab 4) W pomiarach aktywności enzymu (β-galaktozydazy) wykorzystywany jest test analityczny na glukozę jednego z produktów reakcji katalizowanej przez ten enzym. Sposób wykonania testu analitycznego na zawartość glukozy: Z odpowiednio rozcieńczonej próbki pobrać 10 µl do 1 ml Odczynnika I (Glukoza OXY DST, Alpha Diagnostics), inkubować przez 5 min w 37 C, a następnie mierzyć absorbancję przy długości fali 500 nm. Przed rozpoczęciem pomiarów spektrofotometr należy wyzerować na 1 ml Odczynnika I. Pomiar katalitycznej aktywności natywnego enzyme (β-galaktozydazy) Przygotować roztwór substratu (laktozy) o stężeniu 50 g/l w 0,1M buforze fosforanowym ph 7.0 Następnie w termostacie (37 C) umieścić probówkę zawierającą 3 ml tego substratu i inkubować przez około 10 min. W międzyczasie przygotować statyw z 11probówkami i do każdej z nich dodać po 1 ml Odczynnika I (różowego). Po upływie tego czasu, do probówki z preinkubowanym substratem (3mL) dodać 0,3 ml roztworu natywnego enzymu (przygotowanego przez prowadzącego) i włączyć stoper Przez 10 min po każdej 1 minucie reakcji pobrać próbkę z probówki z mieszaniną laktozy i enzymu (10 µl), niezwłocznie zmieszać z 1 ml Odczynnika I (różowego) i umieścić dokładnie na 5 minut w łaźni wodnej (37 C) Następnie zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy 500 nm. Przed pomiarami, aparat musi być wyzerowany (zero base) na 1 ml Odczynnika I. Próbki wyciągnięte z łaźni wodnej (5 min, 37 C) mogą czekać na pomiary absorbancji w temperaturze pokojowej nawet do 25 min. Pomiar katalitycznej aktywności enzymu (β-galactozydazy) immobilizowanego w matrycy hydrożelowej W termostatowanym reaktorze szklanym (37 C) umieścić 30 ml roztworu laktozy o stężeniu 50 g/l i inkubować przez około 10 min. W międzyczasie przygotować statyw z 11 probówkami i do każdej z nich dodać po 1 ml Odczynnika I (różowego). 5

6 Po upływie tego czasu, do reaktora z preinkubowanym substratem (30 ml) dodać 1 hydrożel z immobilizowanym enzymem (3 ml) i włączyć stoper Przez 20 min po każdych 2 minutach reakcji pobrać próbkę z reaktora zawierającego laktozę i immobilizowany enzym (10 µl), niezwłocznie zmieszać z 1 ml Odczynnika I (różowego) i umieścić dokładnie na 5 minut w łaźni wodnej (37 C) Następnie zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy 500 nm. Przed pomiarami, aparat musi być wyzerowany (zero base) na 1 ml Odczynnika I. Próbki wyciągnięte z łaźni wodnej (5 min, 37 C) mogą czekać na pomiary absorbancji w temperaturze pokojowej nawet do 25 min Opracowanie wyników Każda podgrupa do sporządzenia sprawozdania potrzebuje wyniki całej grupy. W sprawozdaniu procedurę wykonania doświadczenia przedstawić graficznie na schemacie (nie przepisywać instrukcji). Wyniki pomiarów aktywności uzyskane dla natywnego i immobilizowanego enzymu przedstawić na wykresie jako: A 500nm = f(t) i na podstawie równania prostej wyznaczyć Wartości aktywności (wyrażone jako ) Wartości aktywności uzyskane dla wszystkich immobilizowanych preparatów enzymu skorelować z ich stężeniem i przedstawić na wykresie (Aktywność immobilizowanego enzymu = f(c ENZYMU ) Dla wszystkich enzymów po immobilizacji wyznaczyć tzw. wydajność pułapkowania Skomentować i podsumować uzyskane wyniki. Literatura [1] Katchalski-Katzir E., Immobilized enzymes learning from past succesess and failures, Trends in Biotechnology 11 (1993) [2] Bryjak J., Immobilizacja enzymów. Część I: Metody konwencjonalne, Wiadomości Chemiczne 58 (2004) [3] Illanes A., Stability of biocatalysts, Journal of Biotechnology 1 (1999) 1-9. [4] Tischer W., Wedekind F, Immobilized enzymes: methods and applications, Top. Curr. Chem (1999) [5] Wong S.S., Wong L.J.C., Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes, Enzyme Microb. Technol. 14 (1992) [6] Fernandez-Lafuente R., Rosell C.M., Rodriguez V., Guisan J.M., Strategies for enzyme stabilization by intramolecular crosslinking with bifunctional reagents, Enzyme Microb. Technol. 17 (1995) [7] Betancor L. Luckarift H.R., Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysisis, Trends Biotechnol. 26 (2008) [26] Mateo C., Palomo J.M., Fernandez-Lorente G., Guisan J.M., Fernandez-Lafuente R., Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques, Enzyme Microb. Technol. 40 (2007)