Izolacja białek i oznaczanie stężeń preparatów białkowych

Transkrypt

1 Izolacja białek i oznaczanie stężeń preparatów białkowych Uwaga: każdy student zobowiązany jest do posiadania na ćwiczeniach fartucha ochronnego, okularów ochronnych oraz rękawiczek ochronnych. W przypadku ich braku student nie zostanie dopuszczony do wykonywania ćwiczenia. Ćwiczenie wykonywane jest w dwóch zespołach 2 lub 3-osobowych. Każdy zespół zobowiązany jest do przyniesienia ok. 40 ml mleka spożywczego. Na ocenę z ćwiczenia (maksymalnie 10 punktów), składają się: 1) 0 3 punktów uzyskane w trakcie, krótkiego 15-minutowego pisemnego kolokwium dotyczącego zagadnień, z którymi należało zapoznać się przed przystąpieniem do ćwiczenia, 2) 0 1 punków uzyskane za wykonanie ćwiczenia, 3) 0 6 punktów uzyskane za opracowanie sprawozdania (czas na przygotowanie: 1 tydzień). Zagadnienia do opracowania (przykładowa literatura podana na końcu instrukcji): 1. Zasada oznaczania stężenia białka metodą Lowry ego. 2. Punkt izoelektryczny białka, właściwości białka w punkcie izoelektrycznym. 3. Składniki mleka krowiego: minerały, witaminy, cukry (laktoza), tłuszcze, frakcje białek w mleku (kazeiny, albuminy, globuliny, itd.) funkcje, budowa, właściwości i zastosowania. Kazeiny, micele kazeinowe - skład, budowa, właściwości, metody izolacji z mleka. 4. Potencjalne zastosowania kazein w chemii nowych materiałów (np. produkcja włókien, klei, tworzyw sztucznych) oraz nano- i bio-matriałów (np. medyczne środki kontrastujące, transportery leków, itd.). Stosowane odczynniki (metoda Lowry'ego): 1. Standard białka 1 mg/ml (1 μg/μl) BSA (Bovine Serum Albumin) 2. Roztwór A: 2% Na 2 CO 3 w 0.1 M NaOH 3. Roztwór B: 5% C 4 H 4 O 6 KNa 4H 2 O (winian sodowo-potasowy, uwodniony) 4. Roztwór C: 2% CuSO 4 5H 2 O 5. Roztwór D: odczynnik Lowry ego (przygotowany wg punktu 1, część 3) 6. 2N odczynnik Folina-Ciocalteu rozcieńczony wodą 1:1 (v/v). Frakcjonowanie mleka i roztwory buforowe: 1. 1,0 M roztwór NaOH 2. 1,0 M roztwór CH 3 COOH 3. 2,0 M roztwór CH 3 COOH 4. 0,2 M roztwór CH 3 COOH 5. 0,2 M roztwór CH 3 COONa Sprzęt laboratoryjny: 1. Spektrofotometr UV-VIS i kuwety plastikowe. 2. Wirówka, waga techniczna. 3. Lejki, kolby stożkowe, bibuła filtracyjna. 4. Zlewki, probówki szklane i plastikowe (Eppendorf), pipety, itd. Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest otrzymanie serwatki oraz kazein z mleka krowiego, a następnie oznaczenie całkowitego stężenia białek serwatki metodą Lowry ego oraz wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazein trzem różnymi metodami. Joanna Loch, ZKiK, Wydział chemii UJ, 2016 Strona 1 z 5

2 Część 1. Frakcjonowanie mleka krowiego cm 3 mleka przelać do kolby stożkowej (poj. 250 ml), dodać 25 cm 3 ciepłej wody (temp. ok. 40 C) a następnie dodawać kroplami, mieszające 1 cm 3 2M kwasu octowego, aż do pojawienia się wyraźnego osadu kazein. 2. Przygotować lejek, sączek z bibuły i czystą kolbę stożkową, a następnie przesączyć wytrącone kazeiny przez saczek. Na czas sączenia zająć się przygotowaniem krzywej wzorcowej do metody Lowry'ego: Część 3 ćwiczenia). 3. Otrzymany przesącz (serwatkę) pozostawić do dalszych oznaczeń, a osadzone na sączku kazeiny przenieść na suchy kawałek bibuły i dokładnie osuszyć. Opisać właściwości fizyczne otrzymanego osadu białkowego. 4. Na wadze technicznej odważyć ok. 1 g osuszonych kazein (resztę pozostawić do wyschnięcia do końca ćwiczenia) i przenieść je do czystej kolby stożkowej, dodać 50 cm 3 ciepłej wody (temp. ok. 40 C), a następnie 4 cm 3 1 M roztworu NaOH, całość dokładnie wymieszać, aż do całkowitego zawieszenia kazein w roztworze. Następnie dodać 4 cm 3 1 M roztworu kwasu octowego w celu zobojętnienia roztworu kazein. Sprawdzić ph przy pomocy papierka wskaźnikowego. Część 2. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazein 1. Przygotować osiem czystych próbówek, opisać je cyframi od 1 do 8, a następnie przygotować w nich odpowiednie roztwory buforowe, wg schematu w tabeli: V [ml] 0,2 M CH 3 COOH V [ml] 0,2 M CH 3 COONa obliczone ph roztworu* 4,50 4,20 3,90 3,40 2,90 2,50 1,50 1,00 0,50 0,80 1,10 1,60 2,10 2,50 3,50 4,00 2. Następnie do każdej probówki dodać po 1 cm 3 roztworu kazeiny i dokładnie wymieszać. 3. Przygotować ślepą próbę do pomiarów spektrofotometrycznych, poprzez zmieszanie w czystej probówce 2 cm 3 0,2 M CH 3 COOH oraz 2 cm 3 0,2 M CH 3 COONa. 4. Wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazein poprzez spektrofotometryczną oceną ilości osadu. Przestawić spektrofotometr w tryb transmitancji i zmierzyć transmitancję przy 500 nm dla każdego roztworu. Po pomiarach, próbkę przelać z powrotem do próbówki (nie wylewać!!!). transmitancja T [%] 500 nm 5. Po pomiarach z probówek 1-8 pobrać próbki po 1 ml do części 4 ćwiczenia (punkt 3a,b), próbówki z pozostałością odstawić na pewien czas (przynajmniej min). 6. Wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazein poprzez wizualną ocenę ilości osadu. Po ok minutach ocenić wizualnie ilość wytrąconego osadu, wpisując w tabeli następujące obserwacje: (brak osadu, zawiesina), + (niewielki osad), ++ (bardzo mocny osad). wizualna ocena osadu Joanna Loch, ZKiK, Wydział chemii UJ, 2016 Strona 2 z 5

3 Część 3. Przygotowanie krzywej wzorcowej do metody Lowry'ego 1. Przygotować odczynnik Lowry ego (roztwór D) mieszając w zlewce z zachowaniem kolejności dodawanych odczynników, dokładnie mieszając po dodaniu każdego składnika: 1) 72 ml roztworu A (2% Na 2 CO 3 w 0.1 M NaOH) 2) 1,5 ml roztworu B (5% C 4 H 4 O 6 KNa 4H 2 O) 3) 1,5 ml roztworu C (2% CuSO 4 5H 2 O). 2. W osobnej zlewce rozcieńczyć 2N odczynnik Folina-Ciocalteu wodą w stosunku 1:1 (v/v). Potrzebna do wykonania ćwiczenia końcowa objętość tego odczynnika wynosi 6.0 ml. 3. W 11 szklanych probówkach, przygotować roztwory do krzywej wzorcowej, zgodnie z protokołem w tabeli (poniżej). Dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut. Po 10 minutach do każdej probówki dodać po 200 μl przygotowanego wcześniej, rozcieńczonego odczynnika Folina i energicznie wymieszać, odczekać 15 minut. Nr probówki roztwór D [ml] BSA H 2 O po 10 min odcz. Folina 1: po 15 min obliczona zawartość BSA [μg] 4. Po tym czasie zmierzyć absorbancję przy długości fali równej. Jako ślepą próbę wykorzystać roztwór nr 0. Wyniki oznaczeń zanotować w powyższej tabeli. Część 4. Oznaczenie stężeń białek metodą Lowry'ego 1. Przygotować otrzymaną wcześniej serwatkę oraz jej odpowiednie rozcieńczenia (2-, 5-, 10- krotne) w probówkach Eppendorf (poj. 1.5 ml), wg tabeli: próbka nr próbka białka do oznaczenia obj. wody obj. serwatki 1. serwatka nie rozcieńczona serwatka 2-krotne rozcieńczenie serwatka 5-krotne rozcieńczenie serwatka 10-krotne rozcieńczenie Joanna Loch, ZKiK, Wydział chemii UJ, 2016 Strona 3 z 5

4 2. Oznaczanie stężenia białek serwatki. Przygotować i podpisać cztery szklane próbki do oznaczenia stężenia białek serwatki metodą Lowry'ego. W kolejnych probówkach zmieszać: a) 2 ml odczynnika Lowry ego (roztwór D), b) 100 μl odpowiednio rozcieńczonej wodą serwatki (patrz tabela wyżej), c) dokładnie wymieszać i odczekać 10 minut. d) po tym czasie do każdej probówki dodać 200 μl odczynnika Folina, e) dokładnie wymieszać i pozostawić na 15 minut f) po tym czasie zmierzyć absorbancję przy ; wyniki oznaczeń zanotować w tabeli. 3. Wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazein poprzez pomiar stężenia białek rozpuszczonych w roztworze (nie wytrąconych) metodą Lowry'ego. a) przygotować i podpisać osiem probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml b) do każdej probówki Eppendorf pobrać po 1 ml roztworu kazein (przygotowanych w części 2), c) probówki Eppendorf umieścić w wirówce i wirować przy x g przez 3 min, d) wyjąć delikatnie probówki Eppendorf z wirówki i ustawić w statywie, e) przygotować i podpisać osiem szklanych probówek do pomiaru stężenia białek, f) w każdej probówce umieścić 2 ml odczynnika Lowry ego (roztwór D), g) do każdej próbówki 1-8 dodać 100 μl nadsączu 1-8 powstałego po wirowaniu, h) dokładnie wymieszać i odczekać 10 minut. i) po tym czasie do każdej probówki dodać 200 μl odczynnika Folina, j) dokładnie wymieszać i pozostawić na 15 minut, k) po tym czasie zmierzyć absorbancję przy ; wyniki oznaczeń zanotować w tabeli: obliczona zawartość białek rozpuszczalnych [μg] Część 5. Opracowanie wyników 1. Opisać krótko skład mleka krowiego: jakie białka zawiera mleko, jakie inne substancje odżywcze oprócz białek obecne są w mleku krowim. Podać, jakiego pochodzenia było mleko używane podczas ćwiczeń (np. producenta mleka, nazwę mleka, deklarowaną zawartość tłuszczu, itd.). 2. Wyjaśnić co to jest punkt izoelektryczny białka, od czego zależy, i jak wpływa on na właściwości, np. na rozpuszczalność białek. 3. Opisać właściwości fizyczne kazein otrzymanych z mleka. 4. Narysować krzywą wzorcową do metody Lowry ego (zależność absorbancji od zawartości białka w [μg]). 5. Obliczyć ph roztworów buforowych otrzymanych w części 2 (punkt 1) wykorzystując równanie Hendersona-Hasselbalcha, przyjmując stałą dysocjacji kwasu octowego K a = 1, : [CH COONa] ph 3 pk a log, przedstawić wszystkie obliczenia. [CH COOH] 3 Joanna Loch, ZKiK, Wydział chemii UJ, 2016 Strona 4 z 5

5 5. Na podstawie analizy danych uzyskanych trzema różnymi metodami, wyznaczyć przybliżoną wartość punktu izoelektrycznego kazein wyizolowanych z mleka. Zestawić dane otrzymane dla kazein w jednej tabeli. Wykorzystując krzywą wzorcową do metody Lowry'ego wyznaczyć zawartość (lub stężenie) białek rozpuszczonych w każdym roztworze buforowym. Przedstawić wszystkie obliczenia. Omówić uzyskane wyniki. 6. Na podstawie krzywej wzorcowej wyznaczyć zawartość białka w analizowanych próbkach serwatki. Przedstawić wszystkie obliczenia. 7. Podsumować wykonane ćwiczenie oraz otrzymane wyniki. Omówić przyczyny ewentualnych błędów i rozbieżności pomiarowych. 8. Opisać potencjalne praktyczne zastosowania w chemii nowych materiałów (a także bio- i nanomateriałów) mogą mieć kazeiny oraz inne białka otrzymywane z mleka. Przy opisie odwołać się do danych znalezionych w wybranej literaturze/publikacjach naukowych. Proponowana, przykładowa literatura: 1. A Guzdek, P. Mak. Praktikum z biochemii Seria wydawnicza WBBiB UJ, Kraków Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z biochemii, PWN. 3. L. Stryer Biochemia, PWN 2003 i nowsze wydania. 4. Lowry O. H., N. J. Rosebrough A.L. Farr, Randall R. J. Protein measurement with the Folin-Phenol reagents, J. Biol. Chem., 193 (1951) Y.D. Livney, Milk proteins as vehicles for bioactives, Current Opinion in Colloid & Interface Science 15 (2010) B. Wróblewska, L. Jędrychowski, Wpływ modyfikacji technologicznych na zmianę właściwości immunoreaktywnych białek mleka krowiego, Alergia, Astma, Immunologia 8 (2003), J. Król, A. Litwińczuk, A. Zarajczyk, Z. Litwińczuk, Alfa-laktoalbumina i beta-laktoglobulina jako związki biologicznie czynne frakcji białkowej mleka, Medycyna Wet. 64 (2008) Stefan Sękowski, Ser gouda z trawy, Młody Technik/Chemia praktyczna, 2015, 08, C. Holt, J. Carver, H. Ecroyd and D.C. Thorn, Invited review: Caseins and the casein micelle: their biological functions, structures, and behavior in foods, J. Dairy Sci. 96 (2013) J. Huang, L. Wang, R. Lin, A.Y. Wang, L. Yang, M. Kuang, W. Qian, H. Mao, Casein-coated iron oxide nanoparticles for high MRI contrast enhancement and efficient cell targeting, ACS Appl Mater Interfaces. 5 (2013) A. Divsalar, M. Razmi, A.A. Saboury, A. Seyedarabi. The design and characterization of a novel betacasein nano-vehicle loaded with platinum anticancer drug for drug delivery. Anticancer Agents Med Chem. 14 (2014) Joanna Loch, ZKiK, Wydział chemii UJ, 2016 Strona 5 z 5