SPEKTROMETRIA FLUORESCENCYJNA CZĄSTECZKOWA. Spektrofluorymetryczne oznaczanie Al w postaci chelatowego kompleksu glinu z moryną.

Transkrypt

1 SPEKTROMETRIA FLUORESCENCYJNA CZĄSTECZKOWA Spektrofluorymetryczne oznaczanie Al w postaci chelatowego kompleksu glinu z moryną. Dr Dorota Sieńko, Zakład Chemii Analitycznej i Analizy Instrumentalnej, Wydział Chemii UMCS w Lublinie A. Cel ćwiczenia: 1. Zapoznać się z obsługą i sposobem przeprowadzania pomiarów przy użyciu spektrofluorometru RF-5001PC firmy Shimadzu. 2. Zarejestrować widmo fluorescencyjne kompleksu glinu z moryną. 3. Oznaczyć zawartość Al w próbce, metodą krzywej kalibracyjnej. Materiały z części B są dostępne w Bibliotece Wydziału Chemii UMCS w Lublinie. C. Opis spektrofluorymetru RF-5001PC firmy Shimadzu. Źródłem promieniowania wzbudzającego jest lampa ksenonowa, o czasie pracy rejestrowanym przez wbudowany rejestrator zużycia lampy. Przyrząd składa się z 2 monochromatorów: promieniowania wzbudzającego i promieniowania emitowanego w zakresie nm, z dokładnością do 2nm i szerokością szczeliny ustawialną na: 1.5nm, 3, 5, 10, 15, 20nm. Szybkość zmian długości fali przy rejestracji widma jest ustawiana w 6 możliwych pozycjach od bardzo szybkiej (180nm/min) do bardzo wolnej. Próbkę w postaci roztworu wlewa się do kwarcowej kuwety umieszczanej w uchwycie wewnątrz aparatu. Przed pomiarem zamyka się pokrywę aparatu. Selektywność ustawiana jest w pozycjach: wysoka i niska. Wysoka jest 100 krotnie wyższa od niskiej. D. Obsługa spektrofluorymetru RF-5001PC. W celu uruchomienia spektrofluorymetru RF-5001PC włącz listwę zasilającą, sprawdź czy lampa ksenonowa na spektrofluorymetrze jest w pozycji on i następnie włącz on - główny włącznik spektrofluorymetru. UWAGA: Włączenie lampy ksenonowej generuje ładunek statyczny, dlatego włączanie spektrofotometru z lampą ksenonową w pozycji on trzeba wykonać przed włączeniem komputera. Włącz komputer i czekaj na pojawienie się głównego ekranu z programami. Znajdź czerwoną ikonę z napisem HYPER RF 1.57, najedź na nią kursorem myszki i kliknij dwa razy lewym przyciskiem myszki w celu otworzenia okna

2 programu służącego do obsługi spektrofluorymetru RF-5001PC. Na ekranie pojawi się okno informacyjne: Kliknij OK i pojawi się ekran: Jest to główny ekran programu Hyper RF 1.57, który umożliwia wprowadzenie potrzebnych komend do przeprowadzenia pomiarów i opracowania otrzymanych wyników pomiarów. Wybierz kursorem myszki komendy: Instrument i RF5000 co zapoczątkuje proces sprawdzania działania przyrządu, pojawi się okno: 2

3 Kolejno zapalające się zielone światło sygnalizuje testowanie działania elementów spektrofluorymetru. Pojawi się mała ikona w lewym dolnym rogu ekranu symbolizująca instrument i jego status Online:... Kliknięcie dwa razy na tej ikonie lub pojedyncze kliknięcie pierwszej komendy Przywróć na tej ikonie spowoduje pojawienie się okna dialogowego, w które należy wprowadzić wszystkie potrzebne parametry do wykonania pomiarów i zarejestrowania wyników: Wprowadź parametry zakresu badania widma (Excitation, Resolution, Emission, Mode, Shutter) jak na przykładzie powyżej. Takie ustawienie parametrów pozwala na pomiar widma fluorescencyjnego. Ustaw kursor na przycisku More, kliknij raz, żeby otworzyć następną stronę z parametrami: 3

4 Ustaw parametry jak przedstawiono na przykładzie. Kliknij OK. Uzasadnienie wprowadzonego zakresu rejestracji widma fluorescencyjnego i wybranej długości fali wzbudzającej (423nm) dla kompleksu Al z moryną znajduje się na Rys. 3 (patrz strona 11 opracowania). E. Wykonanie oznaczeń. Oznaczanie Al w próbce w postaci chelatowego kompleksu glinu z moryną. a) Przygotowanie serii roztworów wzorcowych Al. Do 7 kolbek miarowych o pojemności 10ml odmierzyć: 0.1ml, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 i 0.7ml wzorcowego roztworu Al o stężeniu 0.01mg/ml, dodać po 5ml wody redestylowanej, następnie po 2ml 0.1% alkoholowego rozworu moryny zakwaszonego CH 3 COOH do ph=3, dopełnić kolbki wodą redestylowaną do kreski i dokładnie wymieszać. Stężenia tak przygotowanych wzorców Al wynoszą odpowiednio: 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6 i 0.7 µg/ml. Odstawić na 20 minut. b) Przygotowanie wydanych próbek do analizy. Do otrzymanej próbki w kolbie miarowej o pojemności 10ml dodać 5ml wody redestylowanej, następnie dodać 2ml 0.1% alkoholowego roztworu moryny zakwaszonego CH 3 COOH do ph=3, uzupełnić wodą redestylowaną do kreski i dokładnie wymieszać. Odstawić na 20 minut (20 minut to minimalny czas tworzenia trwałego kompleksu Al z moryną). c) Wykonanie krzywej wzorcowej dla Al. Zmierz natężenie fluorescencji roztworów wzorcowych Al względem wody jako rozpuszczalnika. Na podstawie otrzymanych wyników wykreśl krzywą wzorcową dla Al odkładając na osi odciętych (X) stężenie w µg/ml, a na osi rzędnych (Y) natężenie fluorescencji. Wprowadź wodę redestylowaną do kuwety. 4

5 Kliknij Przywróć na ikonie Online... Kliknij na przycisku Select - wybierz nazwę pliku lub wprowadź własną nazwę na ekranie w oknie: Name:- c:\student\... Text: widmo fluorescencyjne wody, etc. Kliknij Blank, otworzy się okno w którym po 2s rozpocznie się rejestracja widma fluorescencyjnego wody w kuwecie. Pozostaw zarejestrowane widmo wody na ekranie w celu zestawienia razem z widmami roztworów wzorcowych. Wprowadź roztwór wzorcowy Al o najniższym stężeniu 0.1µg/ml do kuwety. Kliknij Przywróć na ikonie Online... Kliknij na przycisku Select - wybierz nazwę pliku lub wprowadź własną nazwę na ekranie w oknie: Name:- c:\student\... Text: widmo fluorescencyjne std 1, etc. Kliknij START, otworzy się okno w którym po 2s rozpocznie się rejestracja widma fluorescencyjnego roztworu w kuwecie. Po zakończeniu rejestracji widma wybierz komendę Calc i Peak Table, kliknij OK, potem pokaże się okno Store table to data set? kliknij Tak. Jeżeli na wykresie widma nie będzie zarejestrowanych wysokości pików, to należy otworzyć komendę Option, a w niej Graphics i Labels pojawi się okno z: Label peak with - zaznacz: X and Intensity. Kliknij OK. W oknie przedstawiającym widmo jest również ikona D (w lewym, dolnym rogu) pozwalająca na korektę podpisu pod otrzymanym widmem (korekta okna Text: ). Zarejestrowane widmo zostaw na ekranie w celu zestawienia widm wszystkich standardów na wykresie. Zarejestruj widma pozostałych wzorców Al. W celu nałożenia widm na siebie wybierz komendę Window JoinVisible. Wydrukuj zestawienie widm. Przedstaw do podpisu osobie prowadzącej ćwiczenia wydrukowane zestawienie widm roztworów wzorcowych i wody jako roztworu odniesienia. Po sprawdzeniu dotychczasowych wyników przez osobę prowadzącą ćwiczenia zamknij wszystkie widma wyświetlone na ekranie. d) Wykonanie oznaczenia Al w próbce. Wprowadź przygotowaną próbkę do kuwety. Zarejestruj widmo fluorescencencyjne próbki zawierającej kompleks Al z moryną, postępując tak jak to opisano dla wzorców Al (punkt c). Pozostaw na ekranie widma fluorescencyjne wszystkich zarejestrowanych próbek. Wydrukuj zestawienie widm dla próbek zaznaczając nazwisko studenta przy każdym z widm, przedstaw wydruk do podpisu przez osobę prowadzącą ćwiczenia. 5

6 F. Zakończenie pracy ze spekrofluorymetrem Shimadzu. Zamknij program HYPER RF 1.57, w tym celu kliknij Przywróć na ikonie Online... W oknie dialogowym parametrów wybierz komendę Scan exit. Zamknij ekran kursor myszki ustaw na krzyżyku i raz kliknij. Wyłącz spektrofotometr off główny przełącznik na obudowie przyrządu. Umyj kuwetę wodą destylowaną. Umyj kuwetę etanolem. G. Opracowanie ćwiczenia powinno zawierać: -zasadę pomiaru (opis ćwiczenia), -najprostszy schemat urządzenia pomiarowego, -wykresy krzywej wzorcowej wraz z zestawieniem wartości fluorescencji dla roztworów wzorcowych, -wyniki analiz indywidualnych próbek, -wyniki z ćwiczeń podpisane przez prowadzącego; a) zestawienie widm fluorescencyjnych wzorców i wody. b) zestawienie widm fluorescencyjnych próbek. H. Literatura; 1. Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa, Andrzej Cygański, Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, PWN, Warszawa, Ryszard Kocjan-redakcja, Chemia analityczna.analiza instrumentalna 2, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, D. Kealey, P.J. Haines, Krótkie wykłady. Chemia Analityczna, PWN, Warszawa

7 Rys. 1. Widmo fluorescencyjne kompleksu Al o stężeniu 0.3µg/ml z moryną, zarejestrowane za pomocą spektrofluorymetru RF-5001PC w celu określenia optymalnej długości fali wzbudzającej (EX- ang. excitation-wzbudzenie) i odpowiadającej temu wzbudzeniu fali emisyjnej (EM- ang. emission-emisja). Rejestracja widma fluorescencyjnego przebiegała w zakresie od 350 do 600nm (oś Y), w zależności od zastosowanej długości fali wzbudzającej od 350 do 500nm (oś X) co 5 nm. Komputer zarejestrował 30 widm fluorescencyjnych w formie wykresu 3dimensional. 7