METODYKA POMIARÓW WIDM ABSORPCJI (WA) NA CARY-300 (Varian) i V-550 (JASCO)

Transkrypt

1 METODYKA POMIARÓW WIDM ABSORPCJI (WA) NA CARY-300 (Varian) i V-550 (JASCO) Czas od włączenia spektrofotometru Cary-300 do momentu uzyskania stabilnej pracy: ok 30 minut., w przypadku V-550 ok. 3h. WA widmo absorpcji, WF widmo emisji Pomiary widma ciągłego: 1) Na początku pomiar linii bazowej i zapisanie jej w pliku pomiar linii bazowej na takich samych ustawieniach parametrów pomiarowych jak późniejsze pomiary absorpcyjne dla badanego układu. W przypadku Cary-300, dla bardzo dokładnych pomiarów ciągłych widm absorpcji najkorzystniejszymi ustawieniami są: czas integracji ( ave time ): 2 lub 4s ( scan rate jest zintegrowany z ustawieniem czasu integracji i kroku pomiarowego). W przypadku pomiarów na V-550 patrz załącznik 1 przy czym przebieg slow odpowiada czasowi integracji 4s z Cary ) Przed wstawieniem kuwet do spektrofotometru należy sprawdzić czystość ich zewnętrznych ścianek! (i usunąć ewentualne zabrudzenia: ślady palców, zacieki, kurz, etc). 3) Pomiar WA rozpuszczalnika (2-kuweta) względem pustej kuwety (nr1) w zakresie nm. 4) Pomiar WA dla kuwet z rozpuszczalnikiem w pełnym, podanym zakresie spektralnym (1- kuweta z rozpuszczalnikiem, odniesienie; 2 kuweta z rozpuszczalnikiem, w której później będzie umieszczony badany związek) jednoczesny pomiar na obu kuwetach 2 względem 1. 5) Wylanie rozpuszczalnika z kuwety nr2, kilkakrotne (min 2) przepłukanie jej badanym roztworem związku (napełnić całą kuwetę gdy jej objętość jest nie większa niż 0.6ml, albo w (20-30)% gdy jej objętość jest większa od 1ml), a następnie wykonanie pomiaru WA roztworu badanego związku względem rozpuszczalnika w pełnym, podanym zakresie spektralnym. W przypadku ilościowego pomiaru WA i dla związków o wąskich pasmach (np. porfiryn) WA ciągłe powinny być mierzone na Cary-300. W celu zmierzenia mniej dokładnego WA możliwy jest również pomiar widma ciągłego na V

2 Przy wyznaczaniu wartości molowego współczynnika ekstynkcji ε, przepłukać kuwetę roztworem badanego związku minimum 3 razy, a po wylaniu rozpuszczalnika odczekać aż w całości wypłynie on z kuwety. Pomiary punktowe: Pomiary punktowe dla danej długości fali powinny być wykonane najpierw dla kuwet z rozpuszczalnikiem, a następnie dla kuwety z badanym roztworem związku względem kuwety z rozpuszczalnikiem tak jak w przypadku pomiarów ciągłych. Jest to bardzo ważny element pomiarów, umożliwiający wyznaczenie bardzo dokładnej wartości ABS dla próbki, koniecznej do wyznaczenia poprawnej wartości Φ F i ε, dlatego nie powinno się go pomijać! Cary-300: 1) Po ustawieniu parametrów pomiarowych w setup, należy najpierw wyzerować Cary-300. Należy wyzerować spektrofotometr przed każdym pomiarem w przypadku zmiany długości fali. 2) Po wyzerowaniu należy wykonać pomiary ABS wg schematu: 1 pomiar pustego aparatu 2 pomiar próbki 3 pomiar próbki 4 pomiar próbki 5 pomiar pustego aparatu Przy czym każdy krok 1, 2, 3, 4, 5 składa się z 3 powtórzeń (ustawienia w setup na replicates=3 ) Wszystkie 5 kroków pomiarowych musi być zachowane! to jest wymagane minimum. Schemat obejmuje pomiary ABS gdy w Cary-300 umieszczone są kuwety 1-rozpuszczalnik i 2-badany związek. Gdy wykonujemy pomiary mające na celu wyznaczenie wpływu kuwet na wartości ABS (w kuwecie 2-rozpuszczalnik względem kuwety 1-rozpuszczalnik), pomiary możemy wykonać pomijając krok 3 i 4 ze schematu. Jasco: 1) Wybieramy w programie opcję Fixed wavelength i następnie Measurement parameter... i dalej: response: slow cycle: 3-2 -

3 oraz przez przycisk add dodajemy kolejne długości fali. 2) Następnie wciskamy przycisk BLANK pomiar linii bazowej. Po pomiarze automatycznie zaznacza się fiszka oznajmująca o uwzględnieniu podczas dalszych pomiarów korekcji na linię bazową (obok przycisku BLANK, fiszka correct ). 3) Dalsze pomiary wykonywane są wg schematu: 1. BLK 3 razy i wartość średnia 2. pomiar na pustym spektrofotometrze (bez kuwet) 3 razy i wartość średnia 3. pomiar badanego związku 3 razy i wartość średnia 4. pomiar badanego związku 3 razy i wartość średnia 5. pomiar badanego związku 3 razy i wartość średnia 6. pomiar na pustym spektrofotometrze (bez kuwet) 3 razy i wartość średnia Powyższy schemat podobnie jak w przypadku pomiarów na Cary-300, obejmuje pomiary ABS, gdy w V-550 umieszczone są kuwety 1-rozpuszczalnik i 2-badany związek. Gdy wykonujemy pomiary mające na celu eliminację wpływu kuwety na wartości ABS (w kuwecie 2-rozpuszczalnik względem kuwety 1-rozpuszczalnik), pomiary możemy wykonać pomijając krok 3 i 4 ze schematu. Przykład dla pełnego schematu: - 3 -

4 Według schematu: BLK-1, BLK-2, BLK-3, BLK to krok 1, 1-1, 1-2, 1-3, 1, to krok 2 2-1, 2-2, 2-3, 2, to krok 3 3-1, 3-2, 3-3, 3, to krok 4 4-1, 4-2, 4-3, 4, to krok 5 5-1, 5-2, 5-3, 5, to krok 6. Wskazówki: Aby uzyskać niezniekształcone WA należy użyć próbkę o 0.1 A max 0.8 (nie przekraczać wartości 1.0). Jeśli tego samego dnia wykonujemy zarówno pomiary WA ciągłe i punktowe, to należy najpierw wykonać wszystkie pomiary (ciągłe i punktowe) dla kuwet z rozpuszczalnikiem. Następnie po przepłukaniu kuwety 2 roztworem badanego związku należy wykonać kolejno WA ciągłe i punktowe. Kolejność tych pomiarów jest dowolna, zwłaszcza przy pomiarach wykonywanych na Cary-300, gdzie można mieć oba programy do pomiarów ( Scan i Advenced Reads ) uruchomione jednocześnie i wystarczy tylko wywołać w programie połączenie ze spektrofotometrem ( Connect ). Opracowanie wyników: W celu opracowania wyników (czy to punktowych czy ciągłych) należy od widma absorpcji związku odjąć widmo absorpcji rozpuszczalnika (tj. widmo absorpcji wykonane na dwóch kuwetach z rozpuszczalnikiem). W przypadku pomiarów punktowych należy również zwrócić uwagę na wartości ABS z pomiaru pustego spektrofotometru i jeśli zachodzi taka konieczność, skorygować uzyskane wartości absorbancji. W przypadku Cary-300, aparat bardzo dobrze się zeruje i utrzymuje wartość zerową. W przypadku V-550 (przykład powyżej) należy odjąć niezerowe wartości absorbancji spektrofotometru. Przypadki szczególne: Czasami zdarza się tak, że rozpuszczalnik absorbuje w zakresie spektralnym, w którym mierzy się WA badanego związku. Wówczas dla pomiarów ABS rozpuszczalnika również musi być zachowany taki sam schemat pomiarowy jak dla próbki

5 Załącznik 1 tabela dotycząca pomiarów WA na V-550 (Jasco)