(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/JP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211754 (21) Numer zgłoszenia: 374192 (22) Data zgłoszenia: 25.07.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 25.07.2003, PCT/JP03/009467 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 18.03.2004, WO04/022733 (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 5/06 (2006.01) C07K 5/068 (2006.01) C07K 5/072 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 9/18 (2006.01) C12N 9/48 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) (54) Enzym tworzący, mikroorganizm i sposób wytwarzania diu (30) Pierwszeństwo: 26.07.2002, JP, 2002-218956 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 03.10.2005 BUP 20/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.06.2012 WUP 06/12 (73) Uprawniony z patentu: AJINOMOTO CO., INC., Tokyo, JP (72) Twórca(y) wynalazku: KENZO YOKOZEKI, Kawasaki, JP SONOKO SUZUKI, Kawasaki, JP SEIICHI HARA, Kawasaki, JP SATOSHI KATAYAMA, Kawasaki, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska PL 211754 B1

2 PL 211 754 B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy enzymu, który łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarza bez przechodzenia przez złożoną syntezę. Dokładniej, wynalazek dotyczy nowego enzymu, który katalizuje reakcję wytwarzania u z karboksylowego komponentu i aminowego komponentu, mikroorganizmu, który wytwarza enzym i sposobu wytwarzania diu z zastosowaniem enzymu lub mikroorganizmu. Peptydy stosuje się w dziedzinach produktów farmaceutycznych, żywności i w różnych innych dziedzinach. Na przykład, ponieważ L-alanylo-L-glutamina ma większą trwałość i rozpuszczalność w wodzie niż L-glutamina, jest szeroko stosowana jako składnik płynu infuzyjnego i pożywek bezsurowiczych. Metody syntezy chemicznej, znane jako metody wytwarzania ów, nie zawsze są proste. Do znanych przykładów takich metod należy sposób, w którym stosuje się N-benzyloksykarbonyloalaninę ("Z-alanina") i zabezpieczoną L-glutaminę (zobacz Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961), Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966 (1962)), sposób, w którym stosuje się Z-alaninę i zabezpieczony ester γ-metylowy kwasu L-glutaminowego (zobacz Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964)), sposób, w którym stosuje się ester Z-alaniny i niezabezpieczony kwas glut (Japońskie Zgłoszenie Nr H1- -96194), sposób obejmujący syntezę pochodnej N-(2-podstawionej)-propionyloglutaminowej jako produktu pośredniego z halogenku 2-podstawionego propionylu jako surowca (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr H6-234715). Ponieważ jednak wszystkie te sposoby wymagają wprowadzenia i usunięcia grup zabezpieczających lub stosowania optycznie czynnych produktów pośrednich, nie uważa się ich za zadowalające w wystarczającym stopniu pod względem przydatności w przemyśle. Z drugiej strony, powszechnie znane przykłady typowych sposobów wytwarzania ów z zastosowaniem enzymów obejmują reakcję kondensacji z zastosowaniem komponentu karboksylowego zabezpieczonego na atomie azotu i niezabezpieczonego na atomie węgla i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego (w dalszej części opisu "Reakcja 1") oraz reakcję podstawienia z zastosowaniem zabezpieczonego na atomie azotu i zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego ("Reakcja 2"). Przykładem Reakcji 1 jest sposób wytwarzania estru metylowego Z-asparaginofenyloalaniny z kwasu Z-asparaginowego i estru metylowego fenyloalaniny (Japońskie Zgłoszenie Nr S53-92729), natomiast przykładem Reakcji 2 jest sposób wytwarzania acetylofenyloalanyloleucynoamidu z estru etylowego acetylofenyloalaniny i leucynoamidu (Biochemical J., 163, 531 (1977)). Bardzo mało jest opisanych przykładów badań nad sposobami z zastosowaniem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego. Przykład reakcji podstawienia z zastosowaniem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego ("Reakcja 3") jest opisany w publikacji WO 90/01555. Jako przykład można wskazać sposób otrzymywania arginyloleucynoamidu z estru etylowego argininy i leucynoamidu. Przykłady reakcji podstawienia z użyciem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, niezabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego ("Reakcja 4") opisano w EP 278787A1 i EP 359399B1. Jako przykład można wskazać sposób otrzymywania tyrozyloalaniny z estru etylowego tyrozyny i alaniny. Najmniej kosztowny spośród wymienionych wyżej Reakcji 1 do 4 sposób wytwarzania należy oczywiście do klasy Reakcji 4, która wymaga najmniej grup zabezpieczających. Przykład Reakcji 4 według dotychczasowego stanu techniki (EP 278787A1) stwarza jednak następujące istotne problemy: (1) wyjątkowo mała szybkość wytwarzania u, (2) niska wydajność wytwarzania u, (3) y, które można wytwarzać są ograniczone do tych, które zawierają aminokwasy o stosunkowo wysokiej hydrofobowości, (4) ilość dodanego enzymu jest wyjątkowo duża oraz (5) potrzebne są stosunkowo drogie preparaty karboksyazy pochodzące z pleśni, drożdży lub roślin.

PL 211 754 B1 3 W Reakcji 4 nie jest znany żaden sposób z zastosowaniem enzymu pochodzącego od bakterii lub drożdży innych niż rodzaj Saccharomyces i nie jest znany sposób otrzymywania alanyloglutaminy i innych wysoce hydrofilowych ów. W tej sytuacji potrzebne jest opracowanie niedrogiego w warunkach przemysłowych sposobu wytwarzania tych ów. Celem wynalazku jest dostarczenie nowego enzymu, który łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarza, bez przechodzenia przez złożone syntezy. W szczególności, celem wynalazku jest dostarczenie nowego enzymu katalizującego reakcję wytwarzającą z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, mikroorganizmu wytwarzającego enzym i sposobu niedrogiego wytwarzania u z użyciem enzymu lub mikroorganizmu. Twórcy wynalazku uzyskali nowy enzym, który wydajnie wytwarza z nowej bakterii należącej do rodzaju Empedobacter i dokonali tego wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Empedobacter, który z komponentu karboksylowego o niezabezpieczonym atomie azotu N i komponentu aminowego tworzy oraz tworzy L-alanylo-L-glutaminę z szybkością 0,03 mm/min lub większą, w reakcji powstawania diu w warunkach (i) do (iv): (i) komponent stanowi chlorowodorek estru metylowego L-alaniny w ilości 100 mm, (ii) komponent stanowi L-glutamina w ilości 200 mm, (iii) ph wynosi 9,0 oraz (iv) ilość dodanego enzymu oczyszczonego do homogeniczności, jest mniejsza niż 0,61 mg/ml, jako ilość białka. Enzym ma przy tym masę cząsteczkową 75 000 oznaczoną elektroforetycznie w żelu SDS a według oznaczenia chromatografią filtracyjną na żelu masa cząsteczkowa wynosi 150 000 a szczep stanowi Empedobacter brevis FERM BP-8113. Korzystnie komponent jako substrat obejmuje zarówno ester aminokwasu i amid aminokwasu. Korzystnie komponent jako substrat stanowi dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym atomie węgla i amina. Enzym według wynalazku tworzy w zakresie ph 6,5-10,5, w zakresie temperatury od 0-60 C. Korzystnie enzym jest niewrażliwy na hamowanie przez inhibitor enzymu serynowego, fluorek fenylometylosulfonylu lecz jest inhibowalny przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu. Przedmiotem wynalazku jest mikroorganizm Empedobacter brevis FERM BP-8113. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania diu, który obejmuje otrzymywanie diu z komponentu karboksylowego o niezabezpieczonym atomie azotu N i komponentu aminowego, w którym stosuje się enzym określony w dowolnym z zastrz. 1-6 lub substancję zawierającą ten enzym. Krótki opis rysunków Fig. 1 jest wykresem przedstawiającym optymalne ph dla enzymu według wynalazku; Fig. 2 jest wykresem przedstawiającym optymalną temperaturę dla enzymu według wynalazku, a Fig. 3 jest wykresem przedstawiającym przebieg w czasie wytwarzania L-alanylo-L-glutaminy z estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy. Sposoby wykonania wynalazku są wyjaśnione szczegółowo w kolejności: (1) Mikroorganizm wytwarzający enzym według wynalazku, (2) Hodowla mikroorganizmu, (3) Oczyszczanie enzymu, (4) Właściwości enzymu, i (5) Metoda syntezy diu. (1) Mikroorganizm wytwarzający enzym według wynalazku Enzymem według wynalazku może być dowolny enzym, który wytwarza z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego i nie ima szczególnych ograniczeń co do organizmów, które wytwarzają taki enzym. W opisie komponent odnosi się do komponentu, który dostarcza grupę karbonylową (CO) w wiązaniu owym (-CONH-), natomiast komponent odnosi się do komponentu, który dostarczy grupę aminową (NH) w wiązaniu owym. Określenie "" użyte samodzielnie odnosi się do polimeru mającego co najmniej jedno lub więcej wiązań owych, jeśli specjalnie nie zaznaczono inaczej. Dodatkowo, określenie "di" odnosi się do u mającego jedno wiązanie owe.

4 PL 211 754 B1 Mikroorganizmem, który wytwarza enzym według wynalazku są bakterie należące do rodzaju Empedobacter, którego szczególne przykłady obejmują Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545). Ujawniono też Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124. Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545, szczep FERM BP-8113) i Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 są mikroorganizmami, które zostały wyselekcjonowane przez twórców wynalazku w wyniku poszukiwania mikroorganizmów, które wytwarzają z wysoką wydajnością z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego. Mikroorganizmy o właściwościach bakteriologicznych podobnych do właściwości Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545) lub Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 są również mikroorganizmami wytwarzającymi enzym według wynalazku. Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545) został zdeponowany w International Patent Organism Depositary w National Institute for Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1 Higashi, miasto Tsukuba, prefektura Ibaraki, Japonia) 1 października 2001 r. i jest oznaczony numerem depozytu FERM P-18545. Zgodnie z postanowieniem Porozumienia Budapeszteńskiego, próbkę kontrolną tego organizmu przekazano następnie 8 lipca 2002 r. do depozytu do International Patent Organism Depositary of National Institute for Advanced Industrial Science and Technology i oznaczono numerem depozytu FERM BP-8113 (oznaczenie mikroorganizmu: Empedobacter brevis szczep AJ 13933). Sphingobacterium szczep AJ 110003 zdeponowano 22 lipca 2002 r. w International Patent Organism Depositary of National Institute for Advanced Industrial Science and Technology i oznaczono numerem depozytu FERM BP-8124. Należy zauważyć, że szczep AJ 110003 został zidentyfikowany jako wspomniany Sphingobacterium sp. Szczep FERM BP-8124 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) jest Gram-ujemną pałeczką (0,7 do 0,8 x 1,5 do 2,0 mikrometrów ("μm")), która nie tworzy przetrwalników i nie jest ruchliwa. Jej kolonie są okrągłe i mają całkowicie gładkie brzegi, zawierają niewielkie wypukłości i mają lśniący, jasnożółty kolor. Organizm wzrasta w 30 C i jest katalazododatni, oksydazododatni i ujemny wobec testu OF (glukoza), i na podstawie tych właściwości został zidentyfikowany jako bakteria należąca do rodzaju Sphingobacterium. Ponadto, na podstawie tego, że jest ujemny w teście redukcji azotanów, ujemny w teście wytwarzania indolu, ujemny w teście otrzymywania z glukozy, ujemny w teście z dihydrolazą argininy, dodatni wobec ureazy, dodatni w teście hydrolizy eskuliny, ujemny w teście hydrolizy żelatyny, dodatni w teście z β-galaktozydazą, dodatni w teście asymilacji glukozy, ujemny w teście asymilacji L-arabinozy, dodatni w teście asymilacji D-mannozy, ujemny w teście asymilacji D-mannitu, dodatni w teście asymilacji N-acetylo-D-glukozoaminy, dodatni w teście asymilacji maltozy, ujemny w teście asymilacji glukonianu potasu, ujemny w teście z kwasem n-kapronowym, ujemny w teście asymilacji kwasu adypinowego, ujemny w teście asymilacji kwasu dl-jabłkowego, ujemny w teście asymilacji cytrynianu sodu, ujemny w teście asymilacji octanu fenylu i dodatni w teście z cytochromooksydazą stwierdzono, że mikroorganizm ma właściwości podobne do właściwości Sphingobacterium multivorum lub Sphingobacterium spiritivorum. Ponadto, mimo że w wyniku przeanalizowania homologii sekwencji bazowej genu 16S rrna wykazano najwyższy stopień homologii (98,8%) ze Sphingobacterium multivorum, nie było szczepu, z którym dopasowanie byłoby całkowite. Omawiany szczep bakteryjny zidentyfikowano jako Sphingobacterium sp. Enzym według wynalazku można otrzymać przez wyizolowanie i oczyszczenie z komórek Empedobacter brevis lub Sphingobacterium sp. Ponadto, enzym według wynalazku a także mikroorganizmy, które wytwarzają enzym można również otrzymywać w oparciu o wyizolowany enzym metodami inżynierii genetycznej. Enzym i mikroorganizm według wynalazku można otrzymywać przez wyizolowanie kodującego enzym według wynalazku w oparciu o wyizolowany i oczyszczony enzym, a następnie ekspresję DNA przez wprowadzenie DNA do odpowiedniego gospodarza. Dodatkowo, enzym mogący wytwarzać z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego można otrzymać również z innych mikroorganizmów przez wytworzenie sondy opartej na polinukleotydzie, która koduje enzym według wynalazku otrzymany z Empedobacter brevis. Różne metody rekombinacji genów są opisane w Molecular Cloning, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Press (1989) i w innych publikacjach. (2) Hodowla mikroorganizmów Dla otrzymania hodowanych komórek mikroorganizmów zawierających enzym stosowany w wynalazku wystarcza, żeby mikroorganizmy były hodowane i wzrastały we właściwej pożywce.

PL 211 754 B1 5 Niema szczególnych ograniczeń dotyczących stosowanej pożywki, pod warunkiem, że pozwala ona na wzrost mikroorganizmów. Pożywką tą może być zwykła pożywka zawierająca zwykłe źródła węgla, źródła azotu, źródła fosforu, źródła siarki, jony nieorganiczne oraz potrzebne źródła organicznych czynników odżywczych. Można na przykład zastosować dowolne źródło węgla, pod warunkiem, że mikroorganizmy mogą je wykorzystać. Do konkretnych przykładów źródła węgla, które można użyć, należą cukry takie jak glukoza, fruktoza, maltoza i amyloza, alkohole takie jak sorbit, etanol i gliceryna, kwasy organiczne takie jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy, kwas octowy i kwas propionowy i ich sole, węglowodory takie jak parafina, a także ich mieszaniny. Przykładowe źródła azotu, które można użyć obejmują sole amonowe soli nieorganicznych takie jak siarczan amonu i chlorek amonu, sole amonowe kwasów organicznych takie jak fumaran amonu i cytrynian amonu, azotany takie jak azotan sodu i azotan potasu, organiczne związki azotu takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i wyciąg namokowy kukurydzy, a także ich mieszaniny. Jako dodatki można odpowiednio domieszać i użyć również zwykłe dodatki odżywcze stosowane w pożywkach, takie jak sole nieorganiczne, sole metali śladowych i witaminy. Nie ma szczególnych ograniczeń co do warunków hodowli i można ją prowadzić na przykład przez około 12 do około 48 godzin przy odpowiedniej kontroli ph i temperatury, odpowiednio w zakresie ph 5 do 8 i zakresie temperatury 15 do 40 C, w warunkach tlenowych. (3) Oczyszczanie enzymu Jako przykład oczyszczania enzymu według wynalazku objaśniono sposób wyodrębniania i oczyszczania wytwarzającego enzymu z Empedobacter brevis. Po pierwsze, z komórek na przykład Empedobacter brevis szczepu FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Central 6, 1-1-1 Higashi, Miasto Tsukuba, Prefektura Ibaraki, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) sporządza się mikroorganizmowy ekstrakt komórkowy przez destrukcję komórek metodą fizyczną taką jak miażdżenie ultradźwiękami lub metodą enzymatyczną z użyciem enzymu rozpuszczającego ścianki oraz oddzielenie frakcji nierozpuszczalnej przez wirowanie. Wytwarzający enzym można następnie wyizolować z ekstraktu komórkowego tak otrzymanego przez kombinację zwykłych sposobów oczyszczania białek takich jak chromatografia anionowymienna, chromatografia kationowymienna lub filtracyjna chromatografia żelowa. Przykładem nośnika, który można zastosować w chromatografii anionowymiennej jest Q-Sepharose HP (wytwarzany przez Amersham). Enzym odzyskuje się we frakcji niezaadsorbowanej w warunkach ph 8,5, gdy umożliwi się przejście ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę wypełnioną nośnikiem. Przykładem nośnika, który można zastosować w chromatografii kationowymiennej jest MonoS HR (wytwarzany przez Amersham). Po zaadsorbowaniu enzymu na nośniku (w kolumnie) przez umożliwienie przejścia ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę wypełnioną nośnikiem a następnie przemyciu kolumny, enzym eluuje się roztworem buforowym o wysokim stężeniu soli. W tym czasie stężenie soli można zwiększać sekwencyjnie lub zwiększać gradientowo. Na przykład, w przypadku użycia MonoS HR, enzym zaadsorbowany na nośniku eluuje się przy stężeniu NaCl około 0,2 do około 0,5 M. Enzym oczyszczony opisanym sposobem można następnie dalej homogenicznie oczyszczać przez filtracyjną chromatografię żelową. Przykładem nośnika do zastosowania w filtracyjnej chromatografii żelowej jest Sephadex 200 pg (wytwarzany przez Amersham). Frakcję z oczyszczania, w której jest obecny enzym można potwierdzić przez zbadanie aktywności każdej frakcji przy wytwarzaniu u opisanym sposobem. (4) Właściwości enzymu według wynalazku Ponieważ enzym według wynalazku jest enzymem, który wytwarza z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, zostanie omówiona korzystna odmiana enzymu według wynalazku z punktu widzenia jego właściwości. Enzym o opisanych właściwościach, dla których szybkość wytwarzania diu jest wykorzystywana jako wskaźnik, jest jedyną korzystną odmianą enzymu według wynalazku. Korzystną odmianą enzymu według wynalazku jest mianowicie enzym, który może wytwarzać z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego i może wykazywać szybkość tworzenia L-alanylo-L-glutaminy

6 PL 211 754 B1 w reakcji wytwarzania diu w warunkach (i) do (iv) korzystnie 0,03 mm/min lub większą, korzystniej 0,3 mm/min lub większą, a szczególnie korzystnie 1,0 mm/min lub większą. Warunki reakcji wytwarzającej di są następujące: (i) em m jest chlorowodorek estru metylowego L-alaniny (100 milimolowy ("mm")); (ii) em m jest L-glutamina (200 mm); (iii) ph wynosi 9,0; i (iv) Ilość dodanego enzymu w przeliczeniu na ilość białka jest mniejsza niż 0,61 mg/ml. Podana ilość dodanego enzymu wskazuje końcową ilość dodanego enzymu, to znaczy dodaną do układu reakcyjnego, a pożądane jest dodanie 0,01 mg/ml lub więcej, a korzystnie 0,02 mg/ml lub więcej w przeliczeniu na ilość białka. Określenie "ilość białka" odnosi się do wartości oznaczonej metodą kolorymetryczną z błękitem brylantowym Coomassiego przy użyciu roztworu CBB do oznaczania białka (dostarczanego przez Nakarai) i albuminy z surowicy bydlęcej jako wzorca. Podana szybkość wytwarzania dalece przewyższa tradycyjną szybkość wytwarzania dla wytwarzania u przy użyciu enzymu a enzym według wynalazku może katalizować wytwarzanie u z wyjątkowo dużą szybkością. Jako szczegółowy przykład sposobu postępowania przy badaniu aktywności enzymu, aktywność enzymu można badać przez doprowadzenie do reakcji enzymu w roztworze buforu boranowego zawierającym ester aminokwasu i aminę jako substraty, z następnym oznaczaniem ilościowym powstającego u. W bardziej szczegółowym przykładzie, doprowadza się do reakcji enzymu przez kilka minut w 25 C, stosując 100 mm roztwór buforu boranowego (ph 9,0) zawierający 100 mm ester metylowy L-alaniny i 200 mm L-glutaminę. Jednostka aktywności enzymu stosowana w wynalazku jest zdefiniowana tak, że 1 jednostka (J) jest ilością enzymu, która wytwarza 1 mikromol u w ciągu jednej minuty w warunkach reakcji w 25 C przy użyciu 100 mm roztworu buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm ester metylowy L-alaniny i 200 mm L-glutaminę. Ponadto, przykładem korzystnej modyfikacji enzymu według wynalazku jest enzym mający właściwości dzięki którym jako substrat dla komponentu karboksylowego może zostać użyty dowolny ester aminokwasu i amid aminokwasu. Sformułowanie "jako substrat może zostać użyty zarówno ester aminokwasu jak i amid aminokwasu" oznacza, że jako substrat może zostać użyty co najmniej jeden rodzaj estru aminokwasu i co najmniej jeden rodzaj amidu aminokwasu. Ponadto, korzystnym rozwiązaniem enzymu według wynalazku jest enzym, który ma właściwość dzięki której jako substrat dla komponentu aminowego mogą zostać użyte dowolny aminokwas, aminokwas zabezpieczony na atomie węgla i amina. Sformułowanie "jako substrat mogą zostać użyte dowolny aminokwas, aminokwas zabezpieczony na atomie węgla i amina" oznacza, że jako substrat mogą zostać użyte co najmniej jeden rodzaj aminokwasu, co najmniej jeden rodzaj aminokwasu zabezpieczonego na atomie węgla i co najmniej jeden rodzaj aminy. W wyniku szerokiego zakresu specyficzności substratu względem komponentu karboksylowego lub komponentu aminowego, enzym według wynalazku jest korzystny w tym znaczeniu, że może zostać dobrany szeroki zakres materiałów wyjściowych, który z kolei jest korzystny pod względem kosztu i aparatury produkcyjnej w przypadku produkcji przemysłowej. Konkretne przykłady komponentów ch obejmują estry L-aminokwasów, estry D-aminokwasów, amidy L-aminokwasów i amidy D-aminokwasów. W dodatku estry aminokwasów obejmują nie tylko estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom występującym w przyrodzie, ale także estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom niewystępującym w przyrodzie lub ich pochodne. Ponadto przykłady estrów aminokwasów obejmują zarówno estry a-aminokwasów jak i estry β-, γ- i ω-aminokwasów i tym podobne, z różnymi miejscami wiązania grupy aminowej. Do typowych przykładów estrów aminokwasów należą estry metylowe, estry etylowe, estry n-propylowe, estry izopropylowe, estry n-butylowe, estry izobutylowe i estry tert-butylowe aminokwasów itp. Konkretne przykłady komponentów ch obejmują L-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla L-aminokwasy, D-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla D-aminokwasy i aminy. W dodatku przykłady amin obejmują nie tylko aminy występujące w przyrodzie, ale także aminy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Ponadto przykłady aminokwasów obejmują nie tylko aminokwasy występujące w przyrodzie, lecz także aminokwasy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Należą do nich zarówno α-aminokwasy jak i β-, γ- lub ω-aminokwasy, z różnymi miejscami wiązania grupy aminowej.

PL 211 754 B1 7 Dodatkowo, pod różnymi względami, korzystną modyfikacją enzymu według wynalazku jest enzym, dla którego zakres ph w którym może być katalizowana reakcja wytwarzania u jest 6,5 do 10,5. Zdolność enzymu według wynalazku do katalizowania tej reakcji w szerokim zakresie ph jest korzystna z tego względu, że umożliwia elastyczne dostosowanie do produkcji przemysłowej, w której mogą występować różne ograniczenia. Przy aktualnej produkcji u korzystnie jest jednak użyć enzym przy dostosowaniu do optymalnego ph odpowiadającego pozyskanemu enzymowi tak, aby maksymalizować efektywność katalityczną enzymu. Ponadto, przykładem innego aspektu korzystnej modyfikacji enzymu według wynalazku jest enzym, dla którego zakres temperatury w jakim enzym może katalizować reakcje wytwarzania u jest w granicach 0 do 60 C. Ponieważ enzym według wynalazku może katalizować reakcję w szerokim zakresie temperatury, jest korzystny ze względu na to, że umożliwia elastyczne dostosowanie do produkcji przemysłowej, w której mogą występować różne ograniczenia. Przy aktualnej produkcji u korzystnie jest jednak użyć enzym przy dostosowaniu do optymalnej temperatury odpowiadającej pozyskanemu enzymowi tak, aby maksymalizować efektywność katalityczną enzymu. (5) Sposób syntezy diu Sposób wytwarzania diu według wynalazku obejmuje syntetyzowanie diu przez umożliwienie enzymowi mogącemu wytwarzać z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego lub substancji, która zawiera ten enzym działania na komponent i komponent. Dla sposobu umożliwienia enzymowi użytemu w wynalazku lub substancji zawierającej enzym działania na komponent i komponent wystarcza, żeby enzym lub substancja zawierająca enzym, komponent i komponent zostały zmieszane. Dokładniej, można zastosować metodę, w której enzym lub substancję zawierającą enzym dodaje się do roztworu zawierającego komponent i komponent i umożliwia się reakcję lub, w przypadku użycia mikroorganizmu wytwarzającego enzym, można zastosować sposób, w którym hoduje się mikroorganizm wytwarzający enzym, enzym znajdujący się w mikroorganizmie lub bulion z hodowli mikroorganizmu oczyszcza się i zatęża, a następnie do bulionu dodaje się komponent i komponent. Zsyntetyzowany di można następnie zebrać standardowymi metodami i w razie potrzeby oczyścić. Określenie "substancja zawierająca enzym" odnosi się do tego, co zawiera enzym, a przykłady konkretnych tego postaci obejmują hodowlę mikroorganizmów wytwarzających enzym, komórki mikroorganizmów wyizolowane z hodowli i produkt obróbki komórek mikroorganizmów. Hodowla mikroorganizmów odnosi się do tego, co uzyskuje się w wyniku hodowania mikroorganizmów, a ściślej do mieszaniny komórek mikroorganizmów, pożywki użytej do hodowli mikroorganizmów oraz substancji wytworzonych przez hodowane mikroorganizmy i tym podobnych. Dodatkowo, komórki mikroorganizmów mogą zostać przemyte i stosowane w postaci przemytych komórek mikroorganizmów. Produkt obróbki komórek mikroorganizmów obejmuje dodatkowo zmiażdżone, lizowane lub liofilizowane komórki mikroorganizmów i obejmuje również surowy enzym odzyskany w wyniku przetworzenia komórek mikroorganizmów a także oczyszczony enzym otrzymany przez oczyszczenie surowego enzymu. Do otrzymania oczyszczonego enzymu można użyć enzym częściowo oczyszczony otrzymany różnymi metodami oczyszczania lub enzym immobilizowany, który immobilizowano przez wiązanie kowalentne, adsorpcję lub pułapkowanie. Dodatkowo, ponieważ niektóre mikroorganizmy zależnie od ich rodzaju są częściowo lizowane podczas hodowli, w takich przypadkach jako substancja zawierająca enzym może również zostać użyty nadsącz z hodowli. Ponadto, stosować można nie tylko dzikie szczepy mikroorganizmów zawierających enzym, ale również szczepy rekombinowane genetycznie. Mikroorganizmy nie są ograniczone do nienaruszonych komórek, lecz można stosować komórki mikroorganizmów po obróbce acetonem, liofilizowane komórki mikroorganizmów lub komórki inaczej obrabiane. Można też stosować immobilizowane komórki mikroorganizmów, które immobilizowano przez wiązanie kowalencyjne, adsorpcję, pułapkowanie lub innymi metodami, a także obrobione immobilizowane komórki mikroorganizmów. Należy zauważyć, że w przypadku użycia hodowli, hodowanych komórek mikroorganizmów lub produktu pochodzącego z poddanych obróbce komórek mikroorganizmów, występują liczne przypadki, w których istnieje enzym, który nie uczestniczy w wytwarzaniu ów, lecz rozkłada otrzymane y i w takich przypadkach jest korzystne dodanie inhibitora metaloproteazy takiego jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), zależnie od przypadku. Dodana ilość jest w zakresie 0,1 mm do 300 mm, a korzystnie 1 mm do 100 mm.

8 PL 211 754 B1 Użyta ilość enzymu lub substancji zawierającej enzym powinna być ilością, przy której wykazany zostaje zamierzony skutek ("skuteczna ilość"). Chociaż ta skuteczna ilość może zostać z łatwością wyznaczona w prostym, wstępnym doświadczeniu przez osobę przeciętnie biegłą w omawianej dziedzinie, w przypadku użycia na przykład enzymu jego użyta ilość wynosi około 0,01 do 100 jednostek (J), podczas gdy w przypadku użycia przemytych komórek mikroorganizmów ich użyta ilość wynosi około 1 do 500 g/l. Użyty może być dowolny komponent, pod warunkiem, że może on wytwarzać przez kondensację z innym substratem w postaci komponentu aminowego. Przykłady komponentów ch obejmują estry L-aminokwasów, estry D-aminokwasów, amidy L-aminokwasów i amidy D-aminokwasów. Przykłady estrów aminokwasów obejmują nie tylko estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom występującym w przyrodzie, ale także estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom niewystępującym w przyrodzie lub ich pochodnych. Ponadto przykłady estrów aminokwasów obejmują zarówno estry α-aminokwasów jak i estry β-, γ- i ω-aminokwasów i tym podobne, z różnymi miejscami związania grupy aminowej. Do typowych przykładów estrów aminokwasów należą estry metylowe, estry etylowe, estry n-propylowe, estry izopropylowe, estry n-butylowe, estry izobutylowe i estry tert-butylowe aminokwasów. Można zastosować dowolny komponent, pod warunkiem, że może on wytwarzać przez kondensację z innym substratem w postaci komponentu karboksylowego. Przykłady komponentów ch obejmują L-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla L-aminokwasy, D-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla D-aminokwasy i aminy. W dodatku przykłady amin obejmują nie tylko aminy występujące w przyrodzie, ale także aminy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Przykłady aminokwasów obejmują nie tylko aminokwasy występujące w przyrodzie, lecz także aminokwasy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Należą do nich zarówno α-aminokwasy jak i β-, γ- i ω-aminokwasy, z różnymi miejscami związania grupy aminowej. Chociaż stężenia komponentu karboksylowego i komponentu aminowego służących jako materiały wyjściowe są odpowiednio 1 mm do 10 M, a korzystnie 0,05 molowe ("M") do 2 M, są przypadki, w których korzystne jest dodanie komponentu aminowego w ilości równej lub większej niż ilość komponentu karboksylowego. Ponadto w przypadku substratów które w wysokich stężeniach hamują reakcję, mogą one być korygowane do stężenia które nie powoduje hamowania i stopniowo dodawane w trakcie reakcji. Temperatura reakcji która umożliwia wytwarzanie u wynosi 0 do 60 C, a korzystnie 5 do 40 C. ph reakcji które umożliwia wytwarzanie u wynosi 6,5 do 10,5, a korzystnie 7,0 do 10,0. Przykłady Przedstawiono bardziej szczegółowe wyjaśnienie wynalazku poprzez jego przykłady. W uzupełnieniu, do potwierdzenia przez barwienie ninhydryną chromatogramów cienkowarstwowych (jakościowo), w celu zbadania produktów wykonywano oznaczenia ilościowe wysokosprawną chromatografią cieczową. Kolumna: InertsiL ODS-2 (produkowana przez GL Science, Inc.), eluat: wodny roztwór fosforanu zawierający 5,0 mm 1-oktanosulfonian sodu (ph 2,1): metanol = 100: 15 do 50, szybkość przepływu: 1,0 ml/min, detekcja: 210 nanometrów ("nm"). P r z y k ł a d 1. Hodowla mikroorganizmu (Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113) 50 ml pożywki (ph 6,2) zawierającej 5 gramów ("g") glukozy, 5 g siarczanu amonu, 1 g fosforanu monopotasowego, 3 g fosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezu, 10 g ekstraktu z drożdży i 10 g peptonu w 1 litrze ("l") przeniesiono do 500 ml kolby Sakaguchi i przez 15 minut sterylizowano w 115 C. Pożywkę tę zaszczepiono następnie jedną ezą bulionu hodowlanego Empedobacter brevis, szczep FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002), który hodowano przez 16 godzin w 30 C w tej samej pożywce, a następnie przez 16 godzin w 30 C w wytrząsarce przy 120 suwach/min. P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie u przy użyciu komórek mikroorganizmów Komórki mikroorganizmów zebrano przez odwirowanie (10000 obrotów na minutę ("obr/min"), 15 minut) bulionu hodowlanego otrzymanego w Przykładzie 1, a następnie zawieszenie do stężenia 100 g/l w 100 mm buforze boranowym (ph 9,0) zawierającym 10 mm EDTA. Po dodaniu odpowiednio 1 ml tej zawiesiny do 1 ml 100 buforu

PL 211 754 B1 9 boranowego (ph 9,0) zawierającego 10 mm EDTA, 200 komponentu karboksylowego i 400 mm aminokwasu dla doprowadzenia do objętości końcowej 2 ml, prowadzono reakcję w 18 C przez 2 godziny. Peptydy otrzymane w wyniku tej reakcji przedstawiono w Tabeli 1. T a b e l a 1 L-Ala-OMe L-Leu L-Ala-L-Leu 38,2 Gly-OMe L-His L-Gly-L-His 22,1 L-Met L-Ala-L-Met 68,3 L-Ser-OMe L-Ser L-Ser-L-Ser 29,0 L-Phe L-Ala-L-Phe 62,4 L-Val-OMe L-Met L-Val-L-Met 10,5 L-Ser L-Ala-L-Ser 51,3 L-Met-OMe L-Phe L-Met-L-Phe 28,5 L-His L-Ala-L-His 52,1 L-Thr-OMe L-Leu L-Thr-L-Leu 23,0 L-Arg L-Ala-L-Arg 72,1 L-Ile-OMe L-Met L-Ile-L-Met 8,3 L-Gln L-Ala-L-Gln 68,0 Wszystkie użyte komponenty karboksylowe były chlorowodorkami. P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie enzymu Czynności po odzieleniu przez wirowanie przeprowadzono bądź w lodzie, bądź w 4 C. Empedobacter brevis, szczep FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) hodowano tak jak w Przykładzie 1, a komórki mikroorganizmów zebrano przez rozdział wirówkowy (10000 obr/min, 15 minut). Po przemyciu 16 g komórek mikroorganizmów 50 mm buforem Tris-HCl (ph 8,0) zawieszono je w 40 ml ("ml" lub "ml") tego samego buforu i poddawano przez 45 minut operacji miażdżenia za pomocą ultradźwięków przy 195 watach. Ciecz po miażdżeniu ultradźwiękami poddano wirowaniu (10000 obr/min, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymania nadsączu cieczy po miażdżeniu ultradźwiękami. Ten nadsącz cieczy po miażdżeniu ultradźwiękami dializowano w ciągu nocy wobec 50 mm buforu Tris-HCl (ph 8,0), a następnie usunięto frakcję nierozpuszczalną przez ultrawirowanie (50000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji rozpuszczalnej w postaci nadsączu. Otrzymaną frakcję rozpuszczalną naniesiono na kolumnę z Q-Sepharose HP (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną buforem Tris-HCl (ph 8,0) i z niezaadsorbowanej frakcji zebrano frakcję aktywną. Tę frakcję aktywną dializowano w ciągu nocy wobec 50 mm buforu octanowego (ph 4,5), a następnie poddano rozdziałowi przez wirowanie (10000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji dializowanej w postaci nadsączu. Następnie tę frakcję dializowaną naniesiono na kolumnę z Mono S (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 50 mm buforem octanowym (ph 4,5) w celu wyeluowania enzymu przy liniowym gradiencie stężenia tego samego buforu zawierającego 0 do 1 M NaCl. Frakcję o najniższym spośród frakcji aktywnych poziomie zanieczyszczających białek naniesiono na kolumnę Superdex 20 pg (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 50 mm buforem octanowym (ph 4,5) zawierającym 1M NaCl i przeprowadzono filtrację żelową przez zapewnienie przepływu tego samego buforu (ph 4,5) zawierającego 1M NaCl przez kolumnę w celu otrzymania roztworu frakcji aktywnej. W wyniku przeprowadzenia tych procedur, na podstawie wyników eksperymentalnych elektroforezy potwierdzono oczyszczenie w sposób powtarzalny wytwarzającego enzymu stosowanego w wynalazku. Stopień odzyskania enzymu w opisanym procesie oczyszczania wyniósł 12,2%, a stopień oczyszczenia był 707-krotny. P r z y k ł a d 4. Pomiar ciężaru cząsteczkowego enzymu Elektroforeza na żelu SDS 0,3 mikrograma (μg) frakcji oczyszczonego enzymu otrzymanej metodą według Przykładu 3 poddano elekroforezie w żelu poliakryloamidowym. Jako roztwór buforowy do elektroforezy zastosowano 0,3% (w/v) Tris, 1,44% (w/v) glicynę i 0,1% (w/v) laurylosulfonian sodu, jako żel poliakryloamidowy zastosowano żel o gradiencie stężenia żelu 10 do 20% (Multigel 10 do 20, produkcji Daiichi

10 PL 211 754 B1 Pure Chemicals), a jako markery ciężaru cząsteczkowego zastosowano markery ciężaru cząsteczkowego Pharmacia. Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwiono błękitem brylantowym Coomassiego R-250 i wykryto jednorodne pasmo w miejscu ciężaru częsteczkowego 75 kilodaltonów ("kda"). Filtracja żelowa Frakcję oczyszczonego enzymu otrzymaną metodą według Przykładu 3 naniesiono na kolumnę z Superdex 200 pg (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 50 mm buforem octanowym (ph 4,5) zawierającym 1M NaCl i w celu zmierzenia ciężaru cząsteczkowego prowadzono filtrację żelową, doprowadzając do przepływu przez kolumnę tego samego buforu (ph 4,5) zawierającego 1M NaCl. W celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej, jako białka wzorcowe o znanych ciężarach cząsteczkowych użyto markery ciężaru cząsteczkowego Pharmacia. w wyniku ciężar cząsteczkowy enzymu wynosił 150 kda. Na podstawie wyników elektroforezy w żelu SDS i filtracji żelowej zasugerowano, że enzym jest homodimerem o ciężarze cząsteczkowym 75 kda. P r z y k ł a d 5. Optimum ph enzymu Wpływ ph sprawdzono w reakcji, w której z chlorowodorku estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy wytwarza się L-alanylo-L-glutaminę. Jako bufory stosowano bufor octanowy (ph 3,9 do 5,4), bufor MES (ph 5,4 do 6,4), bufor fosforanowy (ph 6,0 do 7,9), bufor boranowy (ph 7,8 do 9,3), bufor CAPS (ph 9,3 do 10,7) i bufor K 2 HPO 4 -NaOH (ph 10,8 do 11,6). 1 mikrolitr (μl) frakcji MonoS enzymu otrzymanej w Przykładzie 3 (180 J/ml) dodano do 100 μl każdego buforu (100 mm) zawierającego 100 mm ester metylowy L-alaniny, 200 mm L-glutaminę i 10 mm EDTA i pozostawiono na 5 minut do reakcji w 18 C w celu określenia wpływu ph na reakcję. Wyniki oparte na przypisaniu wartości 100% przypadkowi użycia buforu boranowego (ph 9,3) przedstawiono na Fig. 1. W rezultacie optymalnym ph enzymu było 8 do 9,5. P r z y k ł a d 6. Optymalna temperatura enzymu Wpływ temperatury sprawdzono w reakcji, w której z chlorowodorku estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy wytwarza się L-alanylo-L-glutaminę. 1 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm ester metylowy L-alaniny, 200 mm L-glutaminę i 10 mm EDTA i pozostawiono na 5 minut do reakcji w każdej temperaturze w celu określenia wpływu temperatury na reakcję. Wyniki oparte na przypisaniu wartości 100% aktywności w 34 C przedstawiono na Fig. 2. W rezultacie optymalną temperaturą enzymu było 30 do 40 C. P r z y k ł a d 7. Inhibitory enzymu Wpływ inhibitorów na wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy badano stosując jako substraty chlorowodorek estru metylowego L-alaniny i L-glutaminę. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 50 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającej każdy z inhibitorów enzymu przedstawionych w Tabeli 2 w stężeniu 10 mm i pozostawiono na 5 minut do reakcji w 25 C. Należy zauważyć, że o-fenantrolina, fluorek fenylometylosulfonylu i p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu były przed użyciem rozpuszczone w metanolu do stężenia 50 mm. Aktywność enzymu w każdych warunkach była przedstawiona jako aktywność względna w przypadku przypisania wartości 100 wytwarzaniu L-alanylo-L-glutaminy przy nieobecności inhibitora enzymu. Wyniki te przedstawiono w Tabeli 2. W rezultacie spośród badanych inhibitorów enzymu serynowego enzym nie był hamowany przez fluorek fenylometylosulfonylu, lecz był hamowany przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu. Inhibitor enzymu T a b e l a 2 Względna aktywność wytwarzania L-Ala-L-Gln (%) 1 2 3 Brak 100 Inhibitor metaloenzymu EDTA 96 o-fenantrolina 96

PL 211 754 B1 11 1 2 3 cd. tabeli 2 Inhibitor enzymu SH N-Etylomaleimid 110 Monojodooctan 101 Inhibitor enzymu serynowego Fluorek fenylometylosulfonylu Fluorek 4-(2-aminoetylo)- benzenosulfonylu p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu 115 75 0,1 P r z y k ł a d 8. Wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy z estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy 3 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorku estru metylowego L-alaniny, 200 mm L-glutaminę i 10 mm EDTA i pozostawiono do reakcji w 18 C. W rezultacie, co przedstawiono na Fig. 3, w przypadku szarży z dodanym enzymem otrzymano 83 mm L-alanylo-L-glutaminę (L-Ala-L-Gln), a stężenie produktu ubocznego L-Ala-L-Ala-L-Gln wynosiło 1,3 mm. Z drugiej strony, w szarży bez dodanego enzymu niemal nie obserwowano wytwarzania L-Ala-L-Gln, a stężenie enzymu po reakcji trwającej 120 minut wynosiło 0,07 mm. P r z y k ł a d 9. Wpływ stężenia L-glutaminy na wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy 1 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorku estru metylowego L-alaniny, L-glutaminę w stężeniach przedstawionych w Tabeli 3 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 2 godziny do reakcji w 18 C. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3. T a b e l a 3 Chlorowodorek estru metylowego L-alaniny L-Glutamina L-Ala-L-Gln 100 100 68,2 110 72,1 120 73,3 130 75,1 150 75,5 200 82,0 P r z y k ł a d 10. Specyficzność substratu enzymu (1) Zbadano specyficzność estru w przypadku użycia estru L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm komponenty przedstawione w Tabeli 4, 200 mm L-glutaminę i 10 mm EDTA i pozostawiono na 2 godziny do reakcji w 25 C. Ilości L-Ala-L-Gln otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 4 (w Tabeli 4 HCl oznacza chlorowodorek). T a b e l a 4 L-Ala-L-Gln Ester metylowy L-alaniny HCl 84,3 Ester etylowy L-alaniny HCl 91,5 Ester izopropylowy L-alaniny HCl 78,9 Ester t-butylowy L-alaniny HCl 7,5

12 PL 211 754 B1 P r z y k ł a d 11. Specyficzność substratu enzymu (2) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia estru metylowego L-alaniny jako komponentu karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentu aminowego. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorku estru metylowego L-alaniny, 150 mm L-aminokwasy przedstawione w Tabeli 5 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 5. (Znak + oznacza te y których otrzymanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy śl oznacza ilość śladową.) T a b e l a 5 Gly L-Ala-Gly 13,7 L-Asn L-Ala-L-Asn 65,5 L-Ala L-Ala-L-Ala 25,4 L-Gln L-Ala-L-Gln 79,3 L-Val L-Ala-L-Val 20,8 L-Tyr L-Ala-L-Tyr 17,6 L-Leu L-Ala-L-Leu 45,3 L-CySH L-Ala-L-CySH + L-Ile L-Ala-L-Ile 33,9 L-Lys L-Ala-L-Lys 71,8 L-Met L-Ala-L-Met 83,3 L-Arg L-Ala-L-Arg 88,0 L-Phe L-Ala-L-Phe 74,4 L-His L-Ala-L-His 66,9 L-Trp L-Ala-L-Trp 53,9 L-Asp L-Ala-L-Asp 2,1 L-Ser L-Ala-L-Ser 62,5 L-Glu L-Ala-L-Glu 42,9 L-Thr L-Ala-L-Thr 53,9 L-Pro L-Ala-L-Pro śl P r z y k ł a d 12. Specyficzność substratu enzymu (3) Zbadano wytwarzanie enzymu w przypadku użycia estrów metylowych różnych rodzajów L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego i użycia L-glutaminy jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorku estru metylowego L-aminokwasu (AA- -OMe HCl) przedstawione w Tabeli 6, 150 mm L-glutaminę i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 6. (Znak + oznacza te y dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy śl oznacza ilość śladową.) W przypadku użycia L-Trp-OMe i L-Tyr-Ome do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween-80 do stężenia końcowego 0,1%. T a b e l a 6 1 2 3 4 5 6 Gly-OMe Gly-L-Gln 54,7 L-Tyr-OMe L-Tyr-L-Gln 3,4 L-Ala-OMe L-Ala-L-Gln 74,6 CySH-OMe L-CySH-L-Gln + L-Val-OMe L-Val-L-Gln 15,4 L-Lys-OMe L-Lys-L-Gln + L-Leu-OMe L-Leu-L-Gln + L-Arg-OMe L-Arg-L-Gln 7,1 L-Ile-OMe L-Ile-L-Gln 8,4 L-His-OMe L-His-L-Gln + L-Met-OMe L-Met-L-Gln 12,0 L-Asp-α-OMe α-l-asp-l-gln śl L-Phe-OMe L-Phe-L-Gln 0,9 L-Asp-β-OMe β-l-asp-l-gln śl

PL 211 754 B1 13 1 2 3 4 5 6 L-Trp-OMe L-Trp-L-Gln + L-Glu-α-OMe α-l-glu-l-gln + L-Ser-OMe L-Ser-L-Gln 24,0 L-Glu-γ-OMe γ-l-glu-l-gln + cd. tabeli 6 L-Thr-OMe L-Thr-L-Gln 81,9 L-Pro-OMe L-Pro-L-Gln 2,2 L-Asn-OMe L-Asn-L-Gln + L-Gln-OMe L-Gln-L-Gln 0,3 Wszystkie komponenty karboksylowego użyto w postaci chlorowodorków P r z y k ł a d 13. Specyficzność substratu enzymu (4) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia estrów metylowych różnych L-aminokwasów jako komponentów karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentów ch. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 nm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorku estru metylowego L-aminokwasu (AA-OMe HCl) przedstawione w Tabeli 7, 150 mm L-aminokwasy przedstawione w Tabeli 7 i 10 mm i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 7. ( śl oznacza ilość śladową). W przypadku użycia L-Trp-OMe do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween 80 do stężenia końcowego 0,1%. (Znak + oznacza te y dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca.) T a b e l a 7 Gly-OMe L-Thr-OMe L-Ser-OMe L-Val-OMe L-CySH Gly-L-CySH 45,6 L-Met-OMe L-Ser L-Met-L-Ser 12,8 L-Arg Gly-L-Arg 25,5 L-Met L-Met-L-Met 25,0 L-Phe Gly-L-Phe 44,0 L-Phe L-Met-L-Phe 34,0 L-His Gly-L-His 31,6 L-Ile-OMe L-Ser L-Ile-L-Ser 17,2 L-Lys Gly-L-Lys 9,8 L-Met L-Ile-L-Met 10,0 L-Ser Gly-L-Ser 44,2 L-Phe L-Ile-L-Phe 5,2 Gly L-Thr-Gly 9,4 L-Arg-OMe L-Ser L-Arg-L-Ser 3,6 L-Ala L-Thr-L-Ala 9,4 L-Met L-Arg-L-Met 0,7 L-Val L-Thr-L-Val 0,7 L-Phe L-Arg-L-Phe 1,9 L-Leu L-Thr-L-Leu 28,4 L-Leu-OMe L-Met L-Leu-L-Met 12,2 L-Met L-Thr-L-Met 38,6 L-Trp-OMe L-Met L-Trp-L-Met 4,1 L-Ser L-Thr-L-Ser 58,2 L-Lys-OMe L-Met L-Lys-L-Met 6,8 L-Ser L-Ser-L-Ser 38,0 L-His-OMe L-Met L-His-L-Met 6,5 L-Met L-Ser-L-Met 12,5 L-Asn-OMe L-Glu LAsn-L-Glu 10,2 L-Phe L-Ser-L-Phe 20,3 L-Ser L-Val-L-Ser 30,8 L-Met L-Val-L-Met 10,3 L-Phe L-Val-L-Phe 6,1 Wszystkie komponenty karboksy użyto w postaci chlorowodorków

14 PL 211 754 B1 P r z y k ł a d 14. Specyficzność substratu enzymu (5) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia estrów metylowych form L lub D różnych aminokwasów jako komponentu karboksylowego i form L lub D różnych aminokwasów jako komponentu aminowego. 2 μl samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorki estru metylowego różnych aminokwasów (AA-OMe HCl) przedstawionych w Tabeli 8, 150 mm różne aminokwasy przedstawione w Tabeli 8 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 8. ( śl oznacza ilość śladową.) T a b e l a 8 D-Ala-OMe L-Gln D-Ala-L-Gln 69,3 D-Ala-OMe L-Ser D-Ala-L-Ser 20,3 D-Thr-OMe D-Thr-L-Ser 1,0 D-Ser-OMe D-Ser-L-Ser 3,3 D-Val-OMe D-Val-L-Ser 0,6 D-Met-OMe D-Met-L-Ser 5,1 L-Ala-OMe D-Gln L-Ala-D-Gln 0,3 L-Ala-OMe D-Ser L-Ala-D-Ser 5,4 L-Thr-OMe L-Thr-D-Ser 6,9 L-Ser-OMe L-Ser-D-Ser 16,2 L-Val-OMe L-Val-D-Ser 1,4 L-Met-OMe L-Met-D-Ser 1,9 D-Ala-OMe D-Gln D-Ala-D-Gln śl D-Ala-OMe D-Ser D-Ala-D-Ser 0,2 D-Thr-OMe D-Thr-D-Ser 1,1 D-Ser-OMe D-Ser-D-Ser 2,5 D-Val-OMe D-Val-D-Ser 0,5 D-Met-OMe D-Met-D-Ser 2,7 Wszystkie komponenty karboksylowego użyto w postaci chlorowodorków P r z y k ł a d 15. Specyficzność substratu enzymu (6) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia amidów różnych L-aminokwasów jako komponentów karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentów ch. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm chlorowodorki amidów L-aminokwasów (AA-NH 2 HCl) przedstawionych w Tabeli 9, 150 mm L-aminokwasy przedstawione w Tabeli 9 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 9. T a b e l a 9 1 2 3 4 L-Phe-NH 2 L-Gln L-Phe-L-Gln 0,2 L-Phe-NH 2 L-Ser L-Phe-L-Ser 0,6

PL 211 754 B1 15 1 2 3 4 L-Ala- NH 2 L-Gln L-Ala-L-Gln 7,6 L-Ala-NH 2 L-Met L-Ala-L-Met 3,4 L-Ala-NH 2 L-His L-Ala-L-His 3,9 L-Thr-NH 2 L-Gln L-Thr-L-Gln 0,3 cd. tabeli 9 P r z y k ł a d 16. Specyficzność substratu enzymu (7) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia różnych estrów metylowych L-alaniny jako komponentów ch i zabezpieczonych na atomie węgla L-aminokwasów jako komponentów ch. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm ester metylowy L-aminokwasu (AA- -OMe HCl) przedstawiony w Tabeli 10, 150 mm amidy L-aminokwasów przedstawione w Tabeli 10 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 10. T a b e l a 10 L-Ala-OMe Gly-NH 2 L-Ala-Gly-NH 2 7,4 L-Ala-NH 2 L-Ala-L-Ala-NH 2 8,3 L-Phe-NH 2 L-Ala-L-Phe-NH 2 12,2 P r z y k ł a d 17. Specyficzność substratu enzymu (8) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia estrów metylowych różnych aminokwasów jako komponentów karboksylowego i metyloaminy jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm ester metylowy aminokwasu (AA-OMe HCl) przedstawiony w Tabeli 11, 150 mm metyloaminę przedstawioną w Tabeli 11 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 11. T a b e l a 11 Gly-OMe Metyloamina Gly-metyloamina 1,1 L-Thr-OMe L-Thr-metyloamina 0,2 L-Ala-OMe L-Ala-metyloamina 0,3 P r z y k ł a d 18. Specyficzność substratu enzymu (9) Zbadano wytwarzanie u w przypadku użycia estru β-aminokwasu jako komponentu karboksylowego lub β-aminokwasu jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mm buforu boranowego (ph 9,0) zawierającego 100 mm komponenty karboksylowego przedstawione w Tabeli 12, 150 mm komponenty aminowe przedstawione w Tabeli 12 i 10 mm EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25 C. Ilości każdego z ów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 12. ( śl oznacza ilość śladową.)