Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /2 podpis asystenta ĆWICZENIE 4 KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Wstęp merytoryczny Peroksydazy są enzymami występującymi powszechne zarówno w świecie roślinnym jak i zwierzęcym. Zwierzęce tkanki bogate w te enzymy to: leukocyty, płytki krwi, wątroba i inne tkanki metabolizujące eikozanoidy. Peroksydazy są enzymami należącymi do klasy oksydoreduktaz. Ich grupą prostetyczną jest hem. Enzymy te redukują nadtlenek wodoru lub inne nadtlenki organiczne, np. nadtlenki lipidów, wykorzystując do tego liczne donory elektronów: cytochrom c, askorbinian, hydrochinon, aminy aromatyczne, fenole, indol, kw. moczowy. Są to enzymy pełniące funkcje ochronne, zapobiegające nagromadzaniu się nadtlenków i tworzeniu z nich wolnych rodników. Reakcja katalizowana przez peroksydazy jest trzystopniowa: [Fe(III)] Px + H 2 O 2 [Fe(IV)=O]* + H 2 O kompleks I [Fe(IV)=O]* + AH [Fe(IV)=O] + A kompleks I kompleks II [Fe(IV)=O] + AH [Fe(III)] Px + A + H 2 O kompleks II Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1
Peroksydaza chrzanowa - HRP (EC 1.11.1.7) jest glikoproteiną, o masie cząsteczkowej wynoszącej około 42 kda. Zawiera pojedynczy, luźno związany z apoproteiną hem. Najbogatszym jej źródłem jest sok z chrzanu, kapusty, szczawiu, marchwi, ziemniaków. Enzym wykazuje najwyższą aktywności w ph 5,8-7,5. Na enzymu wpływać może obecność w środowisku reakcji innych niż substraty związków, takich jak np. siarczan hydroksyloaminy i azydek sodu, które są inhibitorami enzymu. Inhibitorem określa się każdą substancję, która zmniejsza szybkość reakcji katalizowanej przez dany enzym. Inhibicja kompetycyjna: Związek będący inhibitorem kompetycyjnym wiąże się z białkiem enzymatycznym w centrum aktywnym uniemożliwiając związanie się enzymu z właściwym substratem. Dochodzi zatem do konkurencji o miejsce wiązania pomiędzy inhibitorem, a substratem, przy czym enzym wykazuje zwykle wyższe powinowactwo do inhibitora, niż do substratu. Inhibitor kompetycyjny może być nie tylko analogiem lub pochodną substratu, ale także alternatywnym substratem danej reakcji lub jej produktem. Przykładem inhibicji kompetycyjnej jest hamowanie dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian będący analogiem strukturalnym bursztynianu. Inhibicja niekompetycyjna: W przypadku inhibicji niekompetycyjnej zarówno inhibitor, jak i substrat nie wywierają wzajemnego wpływu na wiązanie się z białkiem enzymatycznym. Ich wiązanie się z enzymem przebiega niezależnie od siebie, losowo i zachodzi w odmiennych miejscach w strukturze białka enzymatycznego. Efektem związania się inhibitora z enzymem jest obniżenie wartości szybkości maksymalnej (V max ). Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie dehydrogenazy α-ketoglutaranowej przez kwas acetylosalicylowy. Inhibicja mieszana: Inhibicja mieszana jest jedną z odmian inhibicji niekompetycyjnej. W tym przypadku inhibitor może wiązać się zarówno z wolnym enzymem, jak i kompleksem enzym-substrat. Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie syntazy tymidylanowej przez analogi metylenotetrahydrfolianu. Inhibicja akompetycyjna: W przypadku inhibicji akompetycyjnej inhibitor odwracalnie wiąże się z kompleksem enzym-substrat tworząc nieaktywny kompleks potrójny: enzym-substrat-inhibitor. Równocześnie inhibitor nie ma zdolności wiązania się z wolnym enzymem. Efektem tego typu inhibicji jest równoczesne obniżenie o ten sam współczynnik zarówno wartości K m, jak i V max. Przykładem inhibicji akompetycyjnej jest hamowanie dehydrogenazy inozynomonofosforanu przez kwas mykofenolowy. Inhibicja allosteryczna Rodzaj inhibicji kompetycyjnej wywoływanej przez inhibitory nie będące związkami o podobnej do substratu strukturze chemicznej (tzw. inhibicja zwrotna). Inhibitor wiąże się wówczas w miejscu odmiennym niż substrat, co powoduje pojawienie się zmiany konformacyjnej białka enzymatycznego powodującej zniekształcenie miejsca wiązania substratu, a zatem brak możliwości utworzenia kompleksu enzym-substrat. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 2
Doświadczenie 1 Cel: Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej (HRP) Należy wyznaczyć stałą Michaelisa i szybkość maksymalną reakcji katalizowanej przez peroksydazę chrzanową w warunkach zmiennych stężeń gwajakolu, przy stałym stężeniu H 2 O 2 oraz określić rodzaj inhibicji enzymu występujący w obecności: 1) siarczanu hydroksyloaminy; 2) 2) azydku sodowego. Zasada metody: Peroksydaza katalizuje reakcje utleniania niektórych zw. organicznych (aminy aromatyczne, fenole, indol, kwas moczowy) z równoczesną redukcją H 2 O 2., zgodnie z ogólnym równaniem: AH 2 + H 2 O 2 2 O W przeprowadzanym doświadczeniu wykorzystywanym substratem będzie gwajakol (2-metoksyfenol), który w obecności H 2 O 2 pod wpływem HRP ulega utlenieniu, a następnie sprzęgnięciu do tetragwajakolu. Zmiany stężenia powstającego tetragwajakolu (związek o barwie rubinowej) oznaczane są spektrofotometrycznie w sposób ciągły (kinetycznie) poprzez pomiar zmian absorbancji przy długości fali =470 nm. Wzrost stężenia tetragwajakolu jest wprost proporcjonalny do aktywności HRP. Schemat przebiegu reakcji katalizowanej przez HRP: Postępowanie: a. Metodą kinetyczną oznacz peroksydazy chrzanowej (HRP) przy różnych stężeniach gwajakolu (w zakresie 1.25-10.0 mm) i stałym stężeniu H 2 O 2. b. Oznacz HRP przy tych samych stężeniach gwajakolu w obecności siarczanu hydroksyloaminy i azydku sodowego. c. Wykreśl krzywą zależności szybkości reakcji (v) od stężenia gwajakolu (s) w układzie Michaelis-Menten bez inhibitorów oraz w ich obecności. d. Wykreśl krzywą zależności 1/v od 1/s (układ Lineweavera-Burka) dla każdego z ww. układów. e. Metodą graficzną wyznacz wartość K M i V max w każdym z wyznaczonych układów i zapisz uzyskane wartości z uwzględnieniem odpowiednich jednostek. f. Przeprowadź analizę zmian wartości K M i V max w układach z siarczanem hydroksyloaminy i azydku sodowego oraz określ typ inhibicji zachodzącej przy udziale badanych związków. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 3
1. Ustalenie ilości enzymu niezbędnego do przeprowadzenia pomiarów kinetycznych Przygotuj w kuwecie pomiarowej mieszaninę inkubacyjną zawierającą roztwór peroksydazy chrzanowej (HRP) o stężeniu 1 mg/ml rozcieńczony 250-krotnie (gotowy odczynnik), 0.006 mol/l bufor fosforanowy o ph 6.8 i 0.1 mol/l gwajakol zgodnie z tabelą zamieszczoną poniżej. 0.006 mol/l bufor fosforanowy ph 6,8 roztwór HRP 0.1 mol/l gwajakol 1.25 0.05 0.20 Wyzeruj spektrofotometr przy długości fali = 470 nm wobec próbki odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Mieszaninę inkubacyjną umieść w aparacie, wprowadź do niej 0.5 ml roztworu H 2 O 2, zmieszaj i rejestruj zmiany absorbancji przez 2 min. Postaraj się uzyskać w ciągu 1 minuty przyrost absorbancji około 0.4 jednostki przy założeniu, że wykres tej reakcji będzie przez cały ten czas prostoliniowy. Jeżeli prostoliniowość przebiegu tej reakcji zanika przed upływem 1 minuty enzym należy rozcieńczyć. Jeżeli wzrost absorbancji jest mniejszy niż 0.1 jednostki absorbancji, to należy zwiększyć ilość enzymu dodawaną do kuwety. 2. Oznaczanie aktywności peroksydazy w układzie kontrolnym Po dobraniu optymalnego stężenia enzymu w identyczny sposób jak w punkcie 1 oznacz HRP w pozostałych próbkach różniących się stężeniem gwajakolu. W pięciu kuwetach pomiarowych należy przygotować buforowane mieszaniny odpowiednio rozcieńczonego enzymu i różnych stężeń gwajakolu według poniższej tabeli: Uwaga: objętość próbki musi pozostać stała [2ml] - jeżeli konieczne było zwiększenie ilości enzymu, proszę o tę wartość zmniejszyć ilość buforu Nr próbki 0.006 mol/l bufor fosforanowy ph 6,8 roztwór HRP 0.1 mol/l gwajakol końcowe stężenie gwajakolu w próbce [mm] 1 1.250 0.05 0.200 10.0 2 1.300 0.05 0.150 7.5 3 1.350 0.05 0.100 5.0 4 1.400 0.05 0.050 2.5 5 1.425 0.05 0.025 1.25 Wyzeruj spektrofotometr przy długości fali = 470 nm wobec próbki odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Mieszaninę inkubacyjną umieść w aparacie, wprowadź do niej 0.5 ml roztworu H 2 O 2, zmieszaj i rejestruj zmiany absorbancji przez 2 min. Odczytane zmiany absorbancji wpisz do tabeli wyników (pkt. 5). 2.1. Obliczanie aktywności właściwej peroksydazy (K) w warunkach kontrolnych przy różnych stężeniach gwajakolu peroksydazy (K): K = min. v. R. l. V S min x ml gdzie: ΔA/min - wzrost absorbancji w ciągu 1 minuty; v - objętość próbki [2 ml]; l - grubość warstwy roztworu w kuwecie [1cm]; - współczynnik ekstynkcji molarnej dla tetragwajakolu posiada wartość 26.6 mm 1 cm -1 ; Vs - objętość roztworu enzymu w próbce [0.05 ml)]; R - rozcieńczenie enzymu. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 4 mol
Obliczenia: Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 5
3. Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej w obecności inhibitorów 3.1. Oznaczanie aktywności HRP w obecności 0,5 mol/l roztworu azydku sodowego: Nr próbki 0.006 mol/l bufor fosforanowy ph 6,8 HRP 0.1 mol/l gwajakol końcowe stężenie gwajakolu w próbce [mm] 0.5 mol/l roztwór azydku sodowego 1 1.15 0.05 0.20 10.0 0.1 2 1.20 0.05 0.15 7.5 0.1 3 1.25 0.05 0.10 5.0 0.1 4 1.30 0.05 0.05 2.5 0.1 5 1.375 0.05 0.025 1.25 0.1 Wyzeruj spektrofotometr przy długości fali = 470 nm wobec próbki odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Do kolejnych próbek należy dodać 0.5 ml H 2 O 2 i rejestrować zmiany absorbancji w czasie. Jeżeli stopień inhibicji wynosi 100% należy odpowiednio rozcieńczyć inhibitor. Zmiany absorbancji należy wpisać do tabeli wyników. 3.2. Oznaczanie aktywności HRP w obecności 0,5 mol/l roztworu azydku sodowego: Nr próbki 0.006 mol/l bufor fosforanowy ph 6,8 HRP 0.1 mol/l gwajakol końcowe stężenie gwajakolu w próbce [mm] 0.005 mol/l roztwór siarczanu hydroksyloaminy 1 1.15 0.05 0.20 10.0 0.1 2 1.20 0.05 0.15 7.5 0.1 3 1.25 0.05 0.10 5.0 0.1 4 1.30 0.05 0.05 2.5 0.1 5 1.375 0.05 0.025 1.25 0.1 Wyzeruj spektrofotometr przy długości fali = 470 nm wobec próbki odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Do kolejnych próbek należy dodać 0.5 ml H 2 O 2 i rejestrować zmiany absorbancji w czasie. Jeżeli stopień inhibicji wynosi 100% należy odpowiednio rozcieńczyć inhibitor. Zmiany absorbancji należy wpisać do tabeli wyników. 3.3. Obliczanie aktywności właściwej HRP w obecności inhibitorów peroksydazy (K): K = min. v. R. l. V S mol min x ml gdzie: ΔA/min - wzrost absorbancji w ciągu 1 minuty; v - objętość próbki [2 ml]; l - grubość warstwy roztworu w kuwecie [1cm]; - współczynnik ekstynkcji molarnej dla tetragwajakolu posiada wartość 26.6 mm 1 cm -1 ; Vs - objętość roztworu enzymu w próbce [0.05 ml)]; R - rozcieńczenie enzymu. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 6
Obliczenia: Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 7
5. Zestawienie wyników końcowe stężenie gwajakolu [mm] 10.0 1/[s] Δ A/min układ kontrolny 1/ układ z azydkiem sodowym Δ A/min 1/ Δ A/min układ z siarczanem hydroksyloaminy 1/ 7.5 5.0 2.5 1.25 Opracuj wyniki w układzie Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka. Porównaj je ze sobą. Na miejsce szybkości reakcji (v) wstaw wartości aktywności właściwej enzymu (K). Wyznacz wartości: K M i V max i umieść je w poniższej tabeli z uwzględnieniem jednostek, w których się je wyraża: K m. układ kontrolny układ z siarczanem hydroksyloaminy układ z azydkiem sodowym V max typ inhibicji Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 8
Miejsce na wklejenie wykresów Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 9