Imię i nazwisko studenta... nr grupy..

Transkrypt

1 Imię i nazwisk studenta... nr grupy.. Pdpis asystenta... Data... Enzymy Perksydaza chrzanwa: denaturacja i kinetyka enzymatyczna: wyznaczanie stałych katalitycznych (Km, kkat i skutecznści) dla reakcji katalizwanej działaniem perksydazy chrzanwej UZYSKANE WYNIKI LICZBOWE (wartści liczbwe i wymiar) Stała Michaelisa dla, Km:... Prędkść maksymalna Vmax:... Stężenie enzymu w próbce, [E]: 10 nm = 10-8 M =..mm Liczba brtów, stała katalityczna (k kat) = V max/[e]... Skutecznść = k kat/k m... Bufr (stężenie i skład) :... Stężenie gwajaklu (drugi substrat reakcji) w próbce, blicz:... D sprawzdania należy dłączyć wyniki w pstaci: 5 krzywych kinetycznych (na wspólnym wykresie): d t wykresu Michaelisa-Menten, z zaznacznymi stałymi K m, V max wykresu Lineavewera-Burka, z zaznacznymi stałymi -1/K m, 1/V max UWAGA: Prszę przynieść: Kalkulatr z lgarytmami naturalnymi Papier milimetrwy Ołówek i linijka P 1 zdrukwanym kmplecie kart d bliczeń kietyki na 3 sby raz jeśli mżliwe: Laptp z Excel i prszę przumieć się z przygtwalnią w sprawie prgramu na ćwiczenia zainstalwać i nauczyć się używania bezpłatneg prgramu Simfit, pzwalająceg zarówn na bliczanie v, jak i parametrów kinetycznych równania Michaelisa-Menten (wśród wielu innych), i/lub prgramu Ezfit (dem) 1

2 WYNIKI 1. Denaturacja perksydazy Wpisz wyniki dświadczenia d tabeli Oznaczanie katalitycznej aktywnści perksydazy prób 1-6 p działaniu różnych czynników na próby 1-6: Próba Nazwa próby Obserwwana barwa Katalityczna aktywnść perksydazy Tak/nie Denaturacja perksydazy Tak/nie Uwagi 1 Ślepa 2 Kntrlna 3 Działanie temperatury 4 Działanie zasady 5 Działanie kwasu 6 Działanie 8 M mcznika. Przedstaw wniski wynikające z eksperymentu: Jakie czynniki denaturujące znalazłeś? Jak zinterpretujesz wyniki? 2. Kinetyka reakcji katalizwanej przez perksydazę A. Obliczanie stężenia tetragwajaklu pwstałeg w trakcie reakcji katalizwanej a. D Tabeli 1 lub d Tabel 1A-1E, d Tabeli 2 i p przeliczeniu d Tabeli 3 wpisz stężenie nadtlenku wdru w mieszaninach inkubacyjnych, bliczne w Tabeli A prtkłu. b. Wpisz dczytane wartści absrbancji tetragwajaklu TG (prduktu reakcji) przy długści fali 470 nm, p djęciu wartści dla czasu zer: 2

3 d Tabeli 1, gdy dla 5 mieszanin inkubacyjnych planujesz bliczać prędkść pczątkwą reakcji katalizwanej (v ) z użyciem prgramu kmputerweg Excel, umżliwiająceg bliczanie współczynnika kierunkweg stycznej d krzywej kinetycznej (k), przy t = 0, a następnie prędkści pczątkwej reakcji katalizwanej, v *lub d Tabel 1A-1E, gdy planujesz algebraicznie bliczać współczynnik kierunkwy stycznej d krzywej kinetycznej (k), przy t = 0, a następnie prędkść pczątkwą reakcji katalizwanej, v, z użyciem przygtwanych tabel d bliczeń B. Oblicz stężenie tetragwajaklu TG z prawa Lamberta Beera i wyniki dla każdej mieszaniny inkubacyjnej wpisz d Tabeli 1 (*lub d Tabel 1A-1E). TABELA 1. Krzywe kinetyczne Czas reak -cji [min]... mm... mm... mm... mm Inkubacyjna... mm A 470 [mm] A 470 [mm] A 470 [mm] A 470 [mm] A 470 [mm] 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Praw Lamberta Beera: A = ε c l Współczynnik absrbancji mili mlwej tetragwajaklu: 470 TG 266, mm -1 cm -1 Grubść warstwy mierzneg rztwru: Stężenie tetra gwajaklu TG w próbie l = 1 cm = A 470 l [mm] C. Narysuj 5 krzywych kinetycznych (na wspólnej si) z wyników w Tabeli 1 (lub w Tabelach 1A-1E) w układzie współrzędnych: czas reakcji (ś x) i stężenie pwstałeg tetragwajaklu TG (ś y) raz załącz d sprawzdania. 3

4 D. Obliczanie prędkści pczątkwej (v ) reakcji, dla każdej mieszaniny inkubacyjnej, krzystając z bliczneg pwyżej współczynnika kierunkweg (k) stycznej d krzywej kinetycznej: v = - k [S] Oblicz współczynnik kierunkwy (k) stycznej d krzywej kinetycznej, gdy t=0, a następnie prędkść pczątkwą reakcji v = - k [S] (mnżąc współczynnik kierunkwy stycznej (k) i pczątkwe stężenie substratu [S] raz zmieniając znak) i wynik bliczeń wpisz d Tabeli 2 raz p przeliczeniu d Tabeli 3 a. z użyciem prgramu kmputerweg Excel z danych w Tabeli 1 b. lub blicz algebraicznie z danych w Tabelach 1A-1E E. Obliczanie stałych katalitycznych k m, (v max ), k kat i skutecznści, dla reakcji katalizwanej przez perksydazę chrzanwą a. D Tabeli 2 wpisz wartści pczątkweg stężenia nadtlenku wdru (z Tabeli A) raz wartści prędkści pczątkwych reakcji katalizwanej v, bliczne z danych w Tabeli 1, z użyciem prgramu kmputerweg Excel (lub matematycznie według Tabel 1A-1E) dla mieszanin inkubacyjnych - TABELA 2. Krzywa Michaelisa-Menten Stężenie pczątkwe nadtlenku wdru, [S] i [mm] Prędkść pczątkwa reakcji, v i [mm TG. min -1 ] b. Narysuj wykres Michaelisa-Menten z danych w Tabeli 2. Na wykresie zaznacz bliczne stałe katalizwanej reakcji (K m, V max ). Wykres dłącz d sprawzdania. c. Oblicz stałe katalityczne (K m, V max, k kat i skutecznśći), z równania Michaelisa-Menten, krzystając z prgramu kmputerweg Excel i wpisz d Tabeli pniżej raz d Tabeli Wyników. Równanie Michaelisa-Menten vv[s] max 0kE] kat 0[S] 0 0 [ [S]+K 0 m K+[S] m 0 4

5 UWAGA: Stałe katalityczne mżna również bliczyć matematycznie w Tabeli 3A*, krzystając z metdy najmniejszych kwadratów dla równania Lineweavera - Burka (statnia strna tabel d bliczeń). Stała Wartść stałej Wymiar stałej K m V max d. Oblicz pzstałe stałe katalityczne: k kat i skutecznść, (znając stężenie enzymu) i wpisz d Tabeli pniżej raz d Tabeli Wyników. Stała Wzór d bliczeń Wartść stałej Wymiar stałej k kat Skutecznść V max / [E] k kat / [K m e. Przelicz dane z Tabeli 2 i wstaw d Tabeli 3. TABELA 3. Krzywa Lineweavera-Burka 1/[S] i [ mm -1 ] 1/v i [mm -1 TG. min] f. Narysuj wykres Lineweavera-Burka z danych w Tabeli 3 i zaznacz stałe -1/K m raz 1/V max, bliczne pdczas dświadczenia. Wykres dłącz d sprawzdania. Równanie Lineweavera-Burka: 1 Km 1 1 V V [] S V 0 max 0 max 5