SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI TEMATU z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 2012 roku

SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI TEMATU z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 2012 roku 1. Nr decyzji MRiRW: HOR hn 801-15/12, zadanie nr 26 2. Nazwa tematu: Badania nad zwiększeniem odporności żyta na sporysz przez poznanie interakcji pasożyt - żywiciel oraz identyfikację i wykorzystanie genetycznych źródeł odporności na Claviceps purpurea 3. Jednostka realizująca temat: Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu 4. Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu Katedra Fitopatologii 5. Kierownik tematu: prof. dr hab. Zbigniew Weber Wykonawcy: dr Lidia Irzykowska inż. Bożena Hylak - Nowosad 6. Informacja o realizacji prac w roku 2012 a) Materiał i metody I. Ocena zróżnicowania genetycznego populacji Claviceps purpurea pochodzących z poletek w Stacjach Hodowli Roślin i z pól produkcyjnych żyta Wyizolowanie i wyprowadzenie czystych kultur C. purpurea oraz scharakteryzowanie ich makro- i mikroskopowe W badaniach wykorzystano 92 izolaty Claviceps purpurea, spośród których 45 pochodziło ze sklerocjów zebranych z żyta na poletkach doświadczalnych w Stacjach Hodowli Roślin, a 47 izolatów uzyskano ze sklerocjów z pól produkcyjnych żyta północnej Wielkoposki. Ze sklerocjów dezynfekowanych w 1% podchlorynie sodu przez 1 5 minut (w zależności od ich wielkości) wycinano po 5 fragmentów o średnicy około 1 mm i wykładano na pożywkę PDA z dodatkiem streptomycyny (100 µg/ml). Z każdego sklerocjum wybierano losowo 1 kulturę grzyba. Kultury te scharakteryzowano makro- i mikroskopowo (Pažoutová 2001). Ocena szybkości liniowego wzrostu grzybni C. purpurea Jednym z elementów charakterystyki fenotypowej było określenie szybkości wzrostu liniowego grzybni wszystkich analizowanych kultur C. purpurea na pożywce PDA. Po 4 i 7 dniach utrzymywania kultur w ciemności, w temperaturze 20 o C (Golenia, Pawełczyk 1955) mierzono w 3 powtórzeniach średnicę kultur. Z uzyskanych wartości obliczano następnie średnie przyrosty liniowe grzybni w ciągu doby [mm/dobę]. Izolacja DNA z czystych kultur C. purpurea Analizie molekularnej poddano 92 izolaty C. purpurea pochodzące z plantacji produkcyjnych żyta (1-50) oraz z poletek doświadczalnych stacji hodowli (51-100). Izolację DNA wykonano z 10-dniowych kultur C. purpurea, hodowanych na płynnej pożywce glukozowo-drożdżowej (5g/L glukozy, 1g/L ekstraktu drożdżowego). Po odsączeniu pożywki 1

grzybnię roztarto z karborundem i buforem lizującym w celu zniszczenia ścian komórkowych. Całkowity DNA wyizolowano i oczyszczono z białek, polisacharydów, RNA i innych związków wielkocząsteczkowych za pomocą zestawu DNeasy Mini Kit (Qiagen), zgodnie z procedurą rekomendowaną przez producenta. Ilość uzyskanego DNA oceniono spektrofotometrycznie i wyrównano stężenia prób do 80-90 ng/µl. Weryfikacja identyfikacji i ocena zróżnicowania genetycznego populacji Claviceps purpurea pochodzących z poletek doświadczalnych Stacji Hodowli Roślin oraz z pól produkcyjnych żyta W celu weryfikacji poprawności identyfikacji gatunku dokonanej w oparciu o cechy morfologiczne przeprowadzono sekwencjonowanie regionów konserwatywnych rdna (ITS1, 5.8 S rdna, ITS2) oraz fragmentu genu -tubuliny wszystkich 92 izolatów. Do amplifikacji regionów ITS posłużyły startery uniwersalne WIRZ-G50 (CRAACTYGGTCATTTAGAGG) i WIRZ-PN55 (GAGCTYTTSCCGCTTCRCTCGCCG) (Irzykowski, nieopublikowane). Startery do amplifikacji fragmentu genu -tubuliny opracowano specjalnie na potrzeby tego projektu IRZ_tub_outF TCGACCTAGCTCTCAGATTCTTTC i IRZ_tub_outR ACGCTTGAAGAACTCCTGGAT (Irzykowska, nieopublikowane). Mieszanina reakcyjna zawierała: 10 ng matrycowego DNA, 1 M każdy starter, 200 M każdy dntp oraz 0.5 U Taq polimerazy w buforze reakcyjnym 1 stężonym. PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną uprzednio (Irzykowska 2012). Po amplifikacji część produktu PCR oceniono elektroforetycznie. Obecność pojedynczego produktu oczekiwanej długości stanowiło potwierdzenie poprawności amplifikacji. Pozostała część produktu PCR została oczyszczona za pomocą 0.7 U Exonuclease I i 0.2 U Shrimp alkaline phosphatase w celu usunięcia niewłączonych starterów i nukleotydów. Po 30 min inkubacji w 37 C aktywność enzymatyczną zahamowano podgrzewając próbki w 80 C przez 20 minut. Oczyszczone produkty PCR wyznakowano fluorescencyjnie za pomocą Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit z AmpliTaq DNA Polymerase. Do znakowania produktów ITS używano tych samych starterów jak podczas podstawowej amplifikacji, a w przypadku -tubuliny użyto starterów komplementarnych do środkowego regionu uzyskanego produktu PCR (internal sequencing primers): T12 (AACAACTGGGCCAAGGGTCAC) (O'Donnell and Cigelnik, 1997) oraz zaprojektowano IRZ_tub_Clap_in-Rx TCCCATACCAGCACCTGTACCA (Irzykowska, nieopublikowane). ITS sekwencjonowano dwustronnie na całej długości produktu PCR. W przypadku -tubuliny uzyskano obustronny odczyt sekwencji w środkowym ok. 80 nukleotydowym odcinku. W razie wątpliwości, co do jakości w pozostałych odcinkach wykonywano dodatkowe sekwencjonowania nici komplementarnej używając starterów użytych do podstawowej amplifikacji produktu PCR. Rozdział wyznakowanych produktów wykonano w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie na sekwenatorze Applied Biosystems 3730xl Analyzer (w ramach zaplanowanej usługi). 2

Analiza sekwencji Poprawione sekwencje porównano za pomocą programu komputerowego MEGA v. 4 (Tamura et al. 2007). W celu weryfikacji poprawności identyfikacji gatunkowej sekwencje porównano z GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequence Database za pomocą programu komputerowego BLASTN 2.2.26+ (Altschul et al. 1997). Dendrogramy opracowano za pomocą programu komputerowego Treecon for Windows version 1.3b software (Van de Peer i de Wachter 1994). Analiza SRAP i RAPD Przystępując do oceny zróżnicowania genetycznego przeprowadzono najpierw przegląd starterów SRAP i RAPD pod kątem ich przydatności w wykrywaniu polimorfizmu w obrębie gatunku C. purpurea. Z 8 losowo wybranymi matrycami C. purpurea testowano 12 starterów RAPD (OPA-01 - OPA-12), oraz 6 straterów SRAP (AT-CT, CG-CG, TC-GA, GA- TG, TA-AC, TG-GT). W celu weryfikacji uzyskanych wyników każdą reakcję powtórzono. Łącznie przeprowadzono 288 reakcji przeglądowych. Na ich podstawie wybrano startery RAPD i SRAP do analizy pełnych populacji. Skład mieszaniny reakcyjnej oraz warunki reakcji opisano uprzednio (Irzykowska i Bocianowski 2008; Irzykowska et al., 2012). Elektroforeza produktów PCR Produkty reakcji rozdzielano na 1.5% żelu agarozowym z bromkiem etydyny w buforze elektrodowym 1 TBE (89 mm Tris-borate, 2 mm EDTA, ph 8.0) i obserwowano w świetle UV. Jako marker długości uzyskanych produktów PCR zastosowano Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas GMBH, St. Leon-Rot, Germany). Analiza statystyczna zróżnicowania genetycznego izolatów C. purpurea Normalność rozkładu błędów dla modelu testowano przy użyciu testu normalności Shapiro-Wilka. Jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) zastosowano do zweryfikowania hipotezy o braku różnic pomiędzy izolatami pod względem szybkości wzrostu grzybni. Obliczono najmniejsze istotne różnice (NIR) dla wzrostu grzybni i wykorzystano je do wyznaczenia grup jednorodnych. Dwie populacje izolatów (P1 oraz P2) porównano testem t. Współczynniki podobieństwa genetycznego (S) ocenianych izolatów obliczono na podstawie poniższego wzoru: S ij = 2N ij /(N i +N j ), gdzie N ij jest liczbą alleli obecnych u izolatów i oraz j, N i liczba alleli obecnych u izolatu i, N j liczba alleli obecnych u izolatu j, i, j = 1, 2,, 92. Na podstawie obliczonych współczynników izolaty były grupowane hierarchicznie metodą UPGMA. Wyniki tego grupowania przedstawiono w formie dendrogramu. Dodatkowo przeprowadzono, analizę zmienności molekularnej (AMOVA) w celu oceny rozkładu zmienności genetycznej pomiędzy i wewnątrz populacji. Związki pomiędzy markerami molekularnymi a wzrostem grzybni 92 izolatów estymowano poprzez analizy regresji. Obserwacje markerowe były testowane jako zmienne niezależne i rozważane w 3

osobnych modelach. Wszystkie zależności testowano na poziomie istotności α = 0,05. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego GenStat 10.1. II. Wyselekcjonowanie genotypów żyta odpornych lub najmniej podatnych na sporysz Doświadczenie polowe realizowano w trzech Stacjach Hodowli Roślin: - Wiatrowo, Poznańskiej Hodowli Roślin, - Choryń, Danko Hodowla Roślin, - Smolice, Grupa IHAR. W Stacjach tych prowadzono ścisłe doświadczenie polowe założone według tego samego schematu (Ryc. 4). Przedmiot badań stanowiło 90 genotypów żyta (populacyjne 55, męskosterylne /NSIN oraz CSIN/ 9, restorery /WM oraz SR/ 19, męskopłodne /NS/ 6 i mieszaniec -1), po 30 genotypów z poszczególnych Stacji. Ryc. 4. Schemat rozmieszczenia obiektów ścisłego doświadczenia polowego dotyczącego oceny stopnia odporności 90 genotypów żyta na Claviceps purpurea I II III 7 47 90 50 1 66 73 84 30 90 51 45 11 67 77 33 90 87 65 35 21 18 46 10 26 20 36 81 9 73 54 74 51 3 65 13 40 26 33 64 13 60 16 40 86 22 80 28 89 69 72 66 31 1 30 4 89 1 60 57 62 30 39 85 89 50 37 24 19 29 55 2 86 45 80 21 18 88 45 82 25 58 76 32 79 38 34 14 88 75 36 19 84 56 33 17 84 57 3 5 78 82 76 6 26 32 17 52 4 87 70 42 61 59 4

35 2 4 88 8 61 24 37 79 53 63 16 71 42 35 68 11 63 39 16 76 2 23 31 20 86 23 51 50 7 87 43 69 10 71 83 19 85 44 49 29 41 55 15 38 83 59 85 17 83 15 41 12 27 70 54 48 6 73 68 23 22 29 60 3 5 77 62 55 47 77 53 13 53 37 52 28 12 9 81 40 25 7 46 44 49 18 57 58 43 8 10 74 69 56 81 28 75 14 61 36 22 75 48 78 15 70 49 82 64 8 12 5 20 38 25 42 46 32 64 63 66 56 27 21 6 80 72 67 43 27 58 59 34 47 67 44 9 34 14 24 48 41 65 74 52 54 31 39 62 72 68 11 78 79 71 Siew 90 genotypów żyta w trzech lokalizacjach wykonano w trzeciej dekadzie września. Przedplonem był groch w Wiatrowie i Smolicach oraz rzepak w Choryni. Doświadczenie założono na polach o glebie klasy IIIa w Smolicach oraz IVa w Wiatrowie i Choryni. Herbicydy zastosowano jesienią w Choryni (Legato 500 SC oraz Glean 75 WG) i Smolicach (Maraton 375 SC) oraz jesienią (Maraton 375 SC) i wiosną (Mustang Forte 195 SE) w Wiatrowie. W Smolicach, w fazie pierwszego kolanka zastosowano ponadto regulatory 5

wzrostu roślin (Stabilan 750 SL i Moddus 250 EC) oraz tuż przed kwitnieniem żyta insektycyd (Karate Zeon 050 CS). Inokulum stanowiły 4 sklerocja patogena wprowadzone na każdym poletku do ziemi na głębokość 2 centymetrów w połowie października (w fazie 2-3 liści). W okresie wiosny, w fazie kłoszenia określono obsadę roślin żyta na poletkach. Kolejne obserwacje dotyczyły określenia początku kwitnienia, czasu jego trwania i stopnia pylenia (Geiger, Morgenstern 1975). Występowanie sklerocjów w plonie ziarna żyta z poszczególnych poletek oceniano po zbiorze poprzez określenie ich masy w plonie ziarna. Analiza statystyczna uzyskanych wyników Dla określenia istotności różnic między okresami trwania kwitnienia genotypów żyta i oszacowania różnic w procencie występowania sklerocjów patogena w plonie ziarna roślin tych genotypów wykonano dwuczynnikową analizę wariancji. Dla porównania wartości średnich zastosowano test Studenta. b) Szczegółowe omówienie wykonanych prac i uzyskanych wyników I. Ocena zróżnicowania genetycznego populacji Claviceps purpurea pochodzących z poletek w Stacjach Hodowli Roślin i z pól produkcyjnych żyta Charakterystyka makro- i mikroskopowa czystych kultur Claviceps purpurea Wyizolowane kultury patogena były białe, pokryte niskim, watowatym nalotem grzybni. Po około jednym tygodniu na obwodzie tych kultur pojawiał się charakterystyczny pierścień o szerokości 1 mm, na którym nie było nalotu grzybni powietrznej. W preparatach mikroskopowych przygotowywanych z 7 do 14 dniowych kultur obok strzępek i krótkich rozgałęzionych trzonków występowały jajowate, bezbarwne zarodniki konidialne o wymiarach 4,0-9,6 x 2,4-4,0 µm. Podobne, charakterystyczne cechy gatunku C. purpurea podawane są w literaturze (Alderman i współaut. 2004, Ellis i Ellis 1985, Golenia i Pawełczyk 1955). Ocena szybkości liniowego wzrostu grzybni C. purpurea Wyniki analizy wariancji wskazują, że izolaty C. purpurea różniły się szybkością liniowego wzrostu grzybni (Tabela 1). Porównanie szybkości wzrostu grzybni 92 izolatów C. purpurea i obliczenie najmniejszej istotnej różnicy pozwoliło wyodrębnić 30 grup jednorodnych liczących 6 do 34 izolatów (Tabela 2). Tempo wzrostu grzybni mieściło się w zakresie od 1,2 (izolat 87) do 3,3 mm/dobę (izolat 46). Tabela 1. Średnie kwadraty jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) szybkości wzrostu grzybni izolatów C. purpurea Żródło Stopnie Średnie zmienności swobody kwadraty Izolat 91 0,673*** Błąd 184 0,024 *** P<0,001 6

Tabela 2. Średnie wartości szybkości liniowego wzrostu grzybni i grupy jednorodne izolatów Claviceps purpurea różniące się tymi wartościami Izolaty Średnie Odchylenie standardowe 46 37 3,30 3,13 0,00 0,12 48 3,07 0,12 70 3,07 0,12 20 3,00 0,00 99 2,93 0,12 65 2,87 0,29 76 2,87 0,29 11 2,83 0,15 45 2,83 0,15 55 2,80 0,00 75 2,80 0,00 85 2,80 0,00 69 2,77 0,06 39 2,73 0,25 83 2,73 0,06 8 2,70 0,17 51 2,70 0,00 68 2,70 0,17 71 2,70 0,00 79 2,70 0,00 90 2,70 0,00 9 2,63 0,12 10 2,63 0,15 63 2,63 0,12 95 2,60 0,17 16 2,57 0,23 52 2,57 0,12 54 2,57 0,12 91 2,57 0,12 94 2,57 0,23 36 2,53 0,29 6 2,50 0,00 21 2,50 0,00 38 2,50 0,00 42 2,50 0,00 43 2,50 0,00 88 2,50 0,20 89 2,50 0,00 93 2,50 0,00 4 2,43 0,12 28 2,43 0,23 27 2,40 0,26 80 2,40 0,26 56 2,33 0,15 59 2,33 0,15 77 2,33 0,15 57 2,30 0,00 73 2,30 0,00 24 2,27 0,25 92 2,27 0,06 2 2,23 0,25 3 2,23 0,06 23 2,23 0,06 78 2,20 0,00 14 2,17 0,29 32 2,17 0,15 7

67 2,17 0,29 5 2,13 0,12 33 2,13 0,29 50 2,13 0,12 29 2,10 0,17 58 2,10 0,17 72 2,07 0,12 82 2,07 0,12 96 2,07 0,12 7 2,00 0,00 47 1,97 0,29 12 1,93 0,12 18 1,93 0,12 13 1,90 0,17 49 1,87 0,12 1 1,80 0,00 44 1,80 0,00 100 1,80 0,00 34 1,73 0,06 35 1,73 0,06 26 1,70 0,17 30 1,70 0,00 40 1,70 0,00 86 1,70 0,00 98 1,70 0,00 31 1,67 0,29 81 1,67 0,29 25 1,57 0,12 84 1,57 0,23 15 1,50 0,44 60 1,43 0,12 66 1,30 0,00 97 1,30 0,00 17 1,27 0,06 87 1,20 0,00 NIR 0.001 0,42 Średnie wartości liniowego wzrostu grzybni izolatów C. purpurea pochodzących z pól produkcyjnych (2,24 mm/dobę) i izolatów pochodzących z poletek w Stacjach Hodowli Roślin (2,33 mm/dobę) nie różniły się w stopniu istotnym statystycznie (Tabela 3). Tabela 3. Charakterystyki izolatów C. purpurea uwzględniająca ich pochodzenie Charakterystyki Izolaty z pól produkcyjnych (P1) Populacje C. purpurea Izolaty z poletek doświadczalnych (P2) szybkość liniowego wzrostu grzybni Średnie 2,24 2,33 Mediana 2,20 2,50 Minimum Maksimum 1,20 3,30 1,20 3,20 Odchylenie standardowe 0,48 0,49 Współczynnik zmienności 21,54 21,17 Skośność 0,14-0,73 Spłaszczenie -0,56-0,30 podobieństwo genetyczne Średnie 0,66 0,63 Minimum Maksimum 0,3 1,0 0,27 1,0 8

Weryfikacja identyfikacji i ocena zróżnicowania genetycznego populacji Claviceps purpurea pochodzących z poletek doświadczalnych Stacji Hodowli Roślin oraz z pól produkcyjnych żyta Analiza sekwencyjna W pierwszej fazie badań zweryfikowano przynależność gatunkową wszystkich izolatów poprzez sekwencjonowanie regionów konserwatywnych rdna oraz fragmentu genu -tubuliny. Prawidłowość automatycznego odczytu sekwencji sprawdzono manualnie poprzez porównanie go z elektroforogramem i usunięcie błędów występujących zwłaszcza na początku i końcu sekwencji. Łącznie (ITS + -tubulina) przeanalizowano w ten sposób 212 520 nukleotydów (92 650 nt ITS + 92 1660 nt tubulina). Wyniki analizy sekwencyjnej wskazują na największą homologię analizowanych sekwencji 92 izolatów z gatunkiem C. purpurea (Tabele 4 i 5), co potwierdza poprawność identyfikacji. Dla porównania ujęto w analizie sekwencje izolatów referencyjnych oraz sekwencje gatunków pokrewnych z rodzaju Claviceps (Ryc. 1 i 2). Na podstawie analizy sekwencyjnej konserwatywnego regionu rdna pulę 92 izolatów podzielono na 2 grupy GS-1 rdna (łącznie 73 izolaty) i GS-2 rdna (łącznie 19 izolatów) (Ryc. 1). W grupie GS-1 rdna wyodrębniono 6 podgrup (liczących od 2 do 29 izolatów), natomiast grupa GS-2 rdna obejmowała 2 podgrupy (liczące 3 i 16 izolatów). Porównując otrzymane sekwencje z sekwencjami referencyjnymi zdeponowanymi w GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequence Database wykazano nieznaczne różnice, a homologię sekwencji oceniono na 100 99,6% (Tabela 4). Izolaty innych przedstawicieli rodzaju Claviceps były w znacznym stopniu odmienne (Ryc.2). Tabela 4. Porównanie sekwencji rdna izolatów C. purpurea z sekwencjami zdeponowanymi w bazie danych Symbol izolatu Nr izolatu referencyjnego C. purpurea* (autor) Różnice Homologia (%) 3, 20, 24, 27, 28, 37, 39, 42, 45, 46, 49, 58, 59, 60, 78, 82, 96 AJ133401 (Pažoutová) 1 s 99,8 56, 97, 98 AJ133401 (Pažoutová) 0 100,0 50, 74, 75, 79, 92 AJ133400 (Pažoutová) 0 100,0 7, 16 AJ133400 (Pažoutová) 1 s 99,8 5, 10, 11, 15, 21, 23, 35, 38, 48, 52, 57, 76, 77, 81,84, 89, 90 EU344982 (Pažoutová) 0 100,0 12, 13, 18, 25, 26, 29, 30, 31, 33, 34, 40, 43, 47, 51, 55, 65, 67, 70, 71, 73, 85, 86, 87, 88, 91, 93, 94, EU559002 (Douhan) 0 100,0 95, 99 14, 32, 66 EU344982 (Pažoutová) 2 s 99,6 1, 2, 4, 6, 8, 9, 17, 44, 54, 63, 68, 69, 72,80,83, 100 EU558999 (Douhan) 0 100,0 * Numer izolatu referencyjnego zdeponowanego w GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequence Database, s - substytucja 9

Ryc. 1 Dendrogram obrazujący zróżnicowanie sekwencji rdna izolatów C. purpurea z analizowanych populacji na tle izolatów referencyjnych oraz reprezentantów innych gatunków rodzaju Claviceps 10

Na podstawie analizy sekwencyjnej fragmentu genu -tubuliny w puli 92 izolatów wyodrębniono 24 grupy o odmiennych sekwencjach, liczące 1-41 izolatów. W odczytanej sekwencji o długości 1660 nukleotydów ujawniono 47 miejsc polimorficznych, z czego większość (45) stanowiły substytucje (Tabela 5). W sekwencji najbardziej odmiennego izolatu 31 występowała duża, 14-nukleotydowa delecja, przez co homologia do izolatu referencyjnego wynosiła 98,7%. W przypadku pozostałych izolatów homologia sekwencji mieściła się w zakresie od 99,9 do 99,5%. Znacznie bardziej odmienne sekwencje -tubuliny posiadały izolaty innych gatunków rodzaju Claviceps (Ryc. 2). Tabela 5. Porównanie sekwencji fragmentu genu -tubuliny izolatów C. purpurea z sekwencjami zdeponowanymi w bazie danych Nr izolatu referencyjnego Homologia Symbol izolatu Różnice C. purpurea* (%) 63 1s + 1i 3 1s + 1i 1, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 17, 21, 23, 27, 28, 29, 32, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 52, 56, 57, 58, 59, 0s + 1i 60, 69, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 84, 86, 89, 90 FJ711487 (Pažoutová) 55 1s + 1i 7, 12, 16, 47, 49, 82 1s + 1i 87, 88, 91, 93, 95, 99 1s + 1i 72 1s + 1i 99,8 33 1s + 1i 13, 18 1s + 1i 31 3s + 1i + 14d 98,7 48, 51, 68, 70, 71, 80, 83, 94, 97, 98, 100 2s + 1i 99,8 43 5s + 1i 99,6 FJ711485 (Pažoutová) 24 3s + 1i 14 3s + 1i 99,7 20, 37, 46 3s + 1i 66 FJ711487 (Pažoutová) 5s + 1i 99,6 50, 96 6s + 1i 99,5 15 5s + 1i 99,6 54 1s + 1i 99,8 85 6s + 1i 99,5 FJ711485 (Pažoutová) 65 4s + 1i 25 4s + 1i 99,6 2 4s + 1i 30 3s + 1i + 1d *Numer izolatu referencyjnego zdeponowanego w GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequence Database s- substytucja, d- delecja, i- insercja 99,9 11

Ryc. 2 Dendrogram obrazujący zróżnicowanie sekwencji -tubuliny izolatów C. purpurea z analizowanych populacji na tle izolatów referencyjnych oraz reprezentantów innych gatunków rodzaju Claviceps 12

Analiza SRAP i RAPD Scharakteryzowano wstępnie zakres zmienności wewnątrz i między populacyjnej za pomocą analizy polimorfizmu ujawnionego metodami SRAP i RAPD. Na podstawie przeprowadzonej oceny użyteczności starterów (patrz: Metodyka), do oceny zróżnicowania genetycznego wszystkich 92 izolatów C. purpurea wybrano trzy startery SRAP i dwa startery RAPD (Tabela 6) generujące stabilne, polimorficzne fragmenty. W sumie przeprowadzono 460 reakcji. W analizie RAPD i SRAP uzyskano ostatecznie 28 polimorficznych produktów PCR 5-6 na starter (lub parę starterów). Tabela 6. Symbole i sekwencje zastosowanych starterów oraz liczba i długość otrzymanych fragmentów polimorficznych Symbol startera Sekwencja 5 3 Liczba polimorficznych fragmentów OPA-05 AATCGGGCTG 6 OPA-08 GTGACGTAGG 6 mew-gc emw-gc mew-at emw-ct mew-tc emw-ga TGAGTCCAAACCGGGC GACTGCGTACGAATTGC TGAGTCCAAACCGGAT GACTGCGTACGAATTCT TGAGTCCAAACCGGTC GACTGCGTACGAATTGA 6 5 5 Dłogość polimorficznych fragmentów (pz) a-600, b-1300, c-1470, d- 1660, e-1780, f-2550 a-290, b-410, c-590, d-1220, e-2000, f-3000 a-300, b-360, c-550, d-750, e-880, f-1150 a-320, b-390, c-800, d-1310, e-2220 a-300, b-340, c-360, d-620, e-1520 Długość otrzymanych produktów PCR mieściła się w zakresie od 290 do 3000 par zasad (Fot. 1). Porównania profili rozdzielonych elektroforetycznie fragmentów dla każdego startera dokonano na podstawie obecności (1) lub braku (0) produktu SRAP lub RAPD o określonej długości. W oparciu o obliczone współczynniki podobieństwa określono największe podobieństwo genetyczne (równe 1) dla 30 par izolatów (27 28, 36 39, 51 70, 51 71, 51 94, 58 82, 68 80, 68 83, 68 100, 70 94, 71 94, 80 83, 80 100, 83 100, 87 88, 87 91, 87 93, 87 95, 87 99, 88 91, 88 93, 88 95, 88 99, 89 90, 91 93, 91 95, 91 99, 93 95, 93 99, 95 99), oraz najmniejsze (równe 0,21) dla pary 17 72. Relacje między izolatami przedstawiono w formie dendrogramu (Ryc. 3). Średnia wartość podobieństwa genetycznego była równa 0,66 dla izolatów pochodzących z pól uprawnych żyta oraz 0.63 dla izolatów z poletek doświadczalnych (Tabela 3). Istotność zróżnicowania wewnątrz i między populacjami C. purpurea potwierdzono poprzez analizę zmienności molekularnej (AMOVA) (Tabela 7), zgodnie z którą 90% zmienności odnosiło się do różnic w obrębie populacji, a 10% stanowiło zróżnicowanie między populacyjne. Można zauważyć pewne analogie w grupowaniu na podstawie polimorfizmu SRAP i RAPD oraz różnic w sekwencjach rdna i -tubuliny (Ryc. 1, 2, 3). 13

Fot. 1 Przykładowe elektroforogramy dla izolatów Claviceps purpurea z produktami PCR amplifikowanymi za pomocą starterów (A) RAPD-OPA-08 i (B) SRAP_TC-GA (A) (B) Tabela 7.Ocena wewnątrz- i między populacyjnego zróżnicowania genetycznego Claviceps purpurea (AMOVA) Zmienność Między populacyjna Wewnątrz populacyjna Stopnie swobody Suma kwadratów Średni kwadrat Estymator zmienności Procent zmienności Wartość P * 1 27,947 27,947 0,505 10 < 0,001 90 424,901 4,721 4,721 90 < 0,001 Suma 91 452,848 5,226 * Prawdopodobieństwo testowania zakładanych hipotez oszacowano. Liczba permutacji była równa 1000. Na podstawie analizy regresji wykazano także słaby związek czterech markerów molekularnych z szybkością wzrostu grzybni C. purpurea (Tabela 8). 14

Ryc. 3 Dendrogram opracowany na podstawie analizy SRAP i RAPD obrazujący zróżnicowanie genetyczne 92 izolatów Claviceps purpurea 15

Tabela 8. Markery molekularne związane z szybkością wzrostu grzybni Ocena Procent Symbol współczynnika Wartość p wyjaśnianej markera regresji zmienności Błąd standardowy TC_GAd 0,257 0,034 3,8 0,465 OPA_05b 0,239 0,015 5,3 0,461 OPA_08b -0,514 <0,001 12,5 0,443 GC_GCe 0,368 0,026 4,3 0,463 II. Wyselekcjonowanie genotypów żyta odpornych lub najmniej podatnych na sporysz Charaktertystyka warunków pogodowych w okresie wegetacji żyta Średnie miesięczne temperatury od października 2011 do lipca 2012 w Wiatrowie (Tabela 9) prawie zawsze były niższe niż w Choryni (Tabela 10) i Smolicach (Tabela 11). We wszystkich miejscowościach w listopadzie i w marcu zanotowano opady mniejsze od 20 mm, a w pozostałych miesiącach większe od 20 mm. Tabela 9. Charakterystyka warunków pogodowych w okresie wegetacji żyta w Wiatrowie Miesiąc Dekada Średnia temperatura o C Suma opadów (mm) Liczba dni z opadami dekadowa miesięczna dekadowa miesięczna dekadowa miesięczna I 10,3 16,9 3 październik II 4,7 7,0 2,5 21,2 1 5 III 6,0 1,8 1 I 4,5 0,0 0 listopad II -1,2 1,3 0,0 0,0 0 0 III 0,5 0,0 0 I 1,3 21,0 3 grudzień II 0,1 0,6 16,5 57,3 3 17 III 0,3 19,8 11 I 1,1 38,5 9 styczeń II -1,4-2,4 30,3 85,3 7 18 III -6,8 16,5 2 I -15,0 1,2 1 luty II -6,1-6,7 21,2 42,9 5 11 III 1,0 20,5 5 I -0,8 1,4 2 marzec II 5,1 3,4 2,3 14,3 1 5 III 6,0 10,6 2 I 2,7 7,8 3 kwiecień II 5,9 6,8 4,2 23,8 4 10 III 11,8 11,8 3 I 13,1 21,8 3 maj II 11,0 13,4 7,2 29,0 4 7 III 16,2 0,0 0 I 12,7 21,4 6 czerwiec II 16,2 15,3 50,6 89,2 6 17 III 16,9 17,2 5 I 20,2 46,2 7 lipiec II 15,0 18,1 34,8 129,4 8 20 III 19,1 48,4 5 16

Tabela 10. Charakterystyka warunków pogodowych w okresie wegetacji żyta w Choryni Miesiąc Dekada Średnia temperatura o C Suma opadów (mm) Liczba dni z opadami dekadowa miesięczna dekadowa miesięczna dekadowa miesięczna I 11,6 0,0 0 październik II 6,0 7,9 26,0 28,5 4 5 III 6,1 2,5 1 I 5,8 0,0 0 listopad II -0,2 2,3 0,0 0,0 0 0 III 1,3 0,0 0 I 2,1 18,4 2 grudzień II 0,6 1,7 0,9 43,2 1 6 III 2,3 23,9 3 I 2,7 25,4 4 styczeń II -0,3-0,9 28,3 72,3 2 7 III -5,2 18,6 1 I -13,8 0,0 0 luty II -4,3-5,1 20,1 46,3 2 4 III 2,8 26,2 2 I 0,0 3,3 2 marzec II 5,4 3,9 1,9 5,2 1 3 III 6,2 0,0 0 I 2,6 14,3 2 kwiecień II 5,8 6,9 14,4 42,0 2 6 III 12,4 13,3 2 I 13,6 33,1 3 maj II 11,1 13,7 10,0 43,9 1 5 III 16,3 0,8 1 I 12,9 21,5 4 czerwiec II 16,6 15,5 32,4 113,2 3 11 III 17,1 59,3 4 I 20,9 58,2 3 lipiec II 15,3 18,4 26,3 84,5 5 8 III 19,1 0,0 0 Obsada roślin na większości poletek z genotypami żyta we wszystkich trzech Stacjach Hodowli Roślin wynosiła ponad 50% (Tabela 12). Obsadę mniejszą od 50% zanotowano jedynie na poletkach z genotypami: 7, 8, 13, 15, 18 (we wszystkich trzech Stacjach), 3 (w Wiatrowie i Choryni), 14 (w Wiatrowie i Smolicach) 16 oraz 17 (w Choryni) i 89 (w Wiatrowie). Średnio obsada roślin wynosiła: 76% w Wiatrowie, 82% w Choryni i 88% w Smolicach. 17

Tabela 11. Charakterystyka warunków pogodowych w okresie wegetacji żyta wsmolicach Miesiąc Dekada Średnia temperatura o C Suma opadów (mm) Liczba dni z opadami dekadowa miesięczna dekadowa miesięczna dekadowa miesięczna I 11,4 13,5 4 październik II 5,7 7,7 15,7 30,5 4 10 III 6,0 1,3 2 I 5,4 0,0 0 listopad II 0,3 2,3 0,0 0,5 0 1 III 1,2 0,5 1 I 2,0 19,2 8 grudzień II 0,7 1,6 4,4 42,2 5 23 III 2,1 18,6 10 I 2,5 31,1 9 styczeń II -0,4-1,2 25,1 61,8 9 22 III -5,6 5,6 4 I -14,0 0,6 1 luty II -4,6-5,4 19,7 41,1 8 17 III 2,4 20,8 8 I -0,4 3,2 3 marzec II 4,9 3,5 1,2 11,2 3 9 III 6,1 6,8 3 I 2,2 2,7 3 kwiecień II 5,7 6,7 12,6 19,8 4 10 III 12,3 4,5 3 I 13,0 18,6 3 maj II 11,0 13,4 4,5 38,5 3 9 III 16,1 15,4 3 I 12,6 21,8 8 czerwiec II 16,2 15,2 55,5 91,3 5 18 III 16,8 14,0 5 I 20,8 29,4 7 lipiec II 15,1 18,3 29,8 97,8 8 18 III 19,0 38,6 3 Tabela 12. Obsada roślin żyta w fazie kłoszenia na poletkach w roku 2012 Genotyp Procent roślin w stosunku do pełnej obsady nr nazwa Wiatrowo Choryń Smolice 1 GRADAN F1 60 83 97 2 WM 11R 77 93 93 3 WM 18R 40 10 73 4 WM 19R 73 73 97 5 WM 20R 70 60 90 6 WM 29R 70 63 67 7 WM 30R 13 17 27 8 WM 31R 47 43 43 9 WM 32R 50 63 63 10 WM 36R 53 60 60 11 WM 37R 57 57 67 12 WM 38R 73 53 47 13 NS 857N/95 40 10 40 14 NS 841N/00 37 60 43 15 NS 765N/99 27 37 37 18

16 NS 768N/00 70 33 80 17 NS 839N/00 60 40 63 18 NS 794N/00 13 27 47 19 NSIN 596 80 93 93 20 NSIN 1007 73 93 100 21 NSIN 1008 87 97 100 22 NSIN 1009 93 93 93 23 NSIN 1012 100 90 93 24 NSIN 1013 80 100 90 25 NSIN 1023 63 97 100 26 AND 12 70 100 100 27 AND 13 93 90 87 28 AND 15 83 100 100 29 AND 16 90 93 97 30 AND 17 77 100 100 31 D.Złote 80 83 100 32 D.Amber 70 80 87 33 D.Agat 73 90 87 34 CHD 62 83 97 93 35 DC28 70 100 100 36 DC83 87 87 97 37 DC73 83 93 70 38 DC74 97 97 100 39 DC75 90 93 100 40 DC89 73 93 100 41 D.Diament 97 90 83 42 DL 6R 83 77 100 43 MO03/10 93 97 100 44 Szk.1N/10 73 80 93 45 Szk.2N/10 80 97 100 46 Szk. 11/10 83 97 100 47 Szk. 12/10 93 100 100 48 Szk. 10/09 90 67 93 49 LO 558/09 87 73 100 50 LO 669/09 73 100 97 51 SR 20 53 57 93 52 SR 27 87 97 100 53 SR 28 93 83 73 54 SR 29 80 100 100 55 SR 30 87 87 97 56 SR 31 80 100 97 57 SR 32 47 90 80 58 SR 33 80 97 93 59 CSIN 328 90 97 97 60 CSIN 330 80 70 83 61 HRSM 10-4R 100 80 100 62 HRSM 20-4R 87 93 90 63 HRSM 41-4R 97 90 100 64 HRSM 22-4R 77 100 87 65 HRSM 33-4R 63 93 97 66 HRSM 37-4R 77 83 90 67 HRSM 44-4R 93 93 100 68 HRSM 45-4R 90 83 93 19

69 HRSM 46-4R 63 83 90 70 HRSM 47-4R 67 93 97 71 HRSM 48-4R 90 80 93 72 HRSM 49-4R 87 100 87 73 HRSM 50-4R 87 90 83 74 HRSM 51-4R 77 93 100 75 HRSM 52-4R 100 100 100 76 HRSM 53-4R 77 97 100 77 HRSM 55-4R 97 100 100 78 HRSM 56-4R 97 100 100 79 HRSM 57-4R 90 100 100 80 HRSM 58-4R 60 83 100 81 HRSM 59-4R 90 100 100 82 HRSM 60-4R 90 87 100 83 HRSM 61-4R 90 97 100 84 HRSM 62-3R 83 97 93 85 HRSM 63-3R 87 97 100 86 HRSM 64-3R 73 83 77 87 HRSM 65-3R 97 97 93 88 HRSM 66-3R 57 50 70 89 HRSM 67-3R 33 53 63 90 HRSM 68-3R 77 100 100 średnio 76 82 88 Kolorami oznaczono genotypy: białym populacyjne i mieszańca, żółtym restorery, zielonym męsko płodne, różowym - męskosterylne Wyniki analizy wariancji wskazują, że długość okresu kwitnienia żyta zależała od genotypu żyta oraz od miejscowości. Między tymi dwoma czynnikami (AxB) występowała interakcja (Tab. 13). Tabela 13.Średnie kwadraty dwuczynnikowej analizy wariancji czasu trwania kwitnienia żyta Żródło zmienności Stopnie swobody Średnie kwadraty Bloki Genotyp (A) Miejscowość (B) A x B 2 89 2 178 3,577 0,666** 65,169** 0,598** Błąd 538 0,271 ** P < 0,05 Kwitnienie roślin wszystkich genotypów żyta rozpoczęło się w maju, w dniach: 16 w Choryni, 19 w Smolicach i 21 w Wiatrowie (Tabela 14). W Wiatrowie najkrótszy okres kwitnienia wynosił 5,7 (genotypy 22 i 39) do 6,0 dni (genotyp 84), a najdłuższy 9 dni zanotowano u genotypu o numerze 7. W Choryni najkrótszy okres kwitnienia wynosił 3 (genotyp 47) do 3,3 dni (15 genotypów o numerach: 21, 22, 23, 24, 38, 44, 45, 58, 61, 62, 65, 66, 77, 78, 81), a najdłuższy 6,7 (genotypy: 7 i 51) do 7 dni (genotypy: 9, 11, 15). W Smolicach najkrótszy okres kwitnienia wynosił 2,3 (genotyp 23) do 2,7 dni (genotyp 60) a najdłuższy 9 dni (genotypy: 35, 51 i 87). Średni okres kwitnienia 90 genotypów żyta wyrażony liczbą dni wynosił: 4,7 w Choryni, 6,2 w Smolicach i 7,1 w Wiatrowie. Te średnie 20

wartości różniły się w stopniu istotnym statystycznie. We wszystkich trzech Stacjach Hodowli Roślin najniższe stopnie pylenia notowano u mieszańców męskosterylnych. Tabela 14. Charakterystyka kwitnienia żyta w trzech miejscowościach, w maju 2012 roku Genotyp Wiatrowo Choryń Smolice nr nazwa kwitnienie stopień kwitnienie stopień kwitnienie stopień od liczba dni pylenia od liczba dni pylenia od liczba dni pylenia 1 GRADAN F1 23 8,3 u-z 6,7 16 4,3 b-j 4,3 21 6,0 j-s 5,0 2 WM 11R 21 7,0 p-z 8,3 18 4,3 b-j 7,7 21 7,7 r-z 7,3 3 WM 18R 25 7,0 p-z 9,0 25 5,0 d-p 7,0 23 5,3 e-q 5,0 4 WM 19R 23 7,0 p-z 8,3 18 4,3 b-j 8,3 20 7,0 p-z 6,7 5 WM 20R 23 7,0 p-z 8,7 16 5,3 e-q 7,7 20 8,0 s-z 5,0 6 WM 29R 23 8,3 u-z 8,0 21 5,7 f-r 7,7 22 6,0 j-s 5,0 7 WM 30R 25 9,0 z 9,0 21 6,7 n-z 7,0 23 6,7 n-z 7,0 8 WM 31R 23 7,0 p-z 8,7 21 5,7 f-r 7,7 21 6,0 j-s 7,0 9 WM 32R 21 7,7 r-z 8,3 21 7,0 p-z 9,0 22 6,0 j-s 7,0 10 WM 36R 23 6,7 n-z 8,7 21 6,0 j-s 8,3 21 7,7 r-z 7,0 11 WM 37R 21 7,0 p-z 8,3 16 7,0 p-z 7,0 21 6,7 n-z 7,0 12 WM 38R 23 7,0 p-z 8,0 21 5,0 d-p 8,3 23 5,3 e-q 7,0 13 NS 857N/95 28 7,7 r-z 8,7 23 5,7 f-r 7,0 23 5,7 f-r 7,0 14 NS 841N/00 23 7,7 r-z 8,0 21 4,7 c-n 7,0 23 5,3 e-q 7,0 15 NS 765N/99 23 8,3 u-z 9,0 23 7,0 p-z 7,0 22 5,0 d-p 7,0 16 NS 768N/00 25 7,0 p-z 8,7 18 5,0 d-p 7,7 23 4,7 c-l 7,0 17 NS 839N/00 25 8,7 w-z 9,0 21 4,3 b-j 7,0 23 3,7 a-e 7,0 18 NS 794N/00 23 8,3 u-z 8,7 21 5,3 e-q 7,3 23 4,7 c-n 7,0 19 NSIN 596 23 8,3 u-z 4,7 16 5,7 f-r 2,7 21 5,0 d-o 2,3 20 NSIN 1007 23 7,0 p-z 3,3 18 4,7 c-n 1,7 20 4,3 b-g 2,0 21 NSIN 1008 23 7,7 r-z 3,7 18 3,3 a-d 2,7 21 3,7 a-e 2,3 22 NSIN 1009 21 5,7 f-r 4,3 21 3,3 a-d 2,7 22 3,0 a-c 2,0 23 NSIN 1012 21 8,3 u-z 3,7 16 3,7 a-e 2,0 22 2,3 a 2,0 24 NSIN 1013 21 7,7 r-z 2,7 18 3,3 a-d 1,7 22 3,7 a-e 3,0 25 NSIN 1023 23 7,0 p-z 3,3 16 4,0 b-g 3,0 20 5,0 d-p 2,3 26 AND 12 23 7,0 p-z 9,0 18 4,3 b-j 9,0 20 7,0 p-z 8,7 27 AND 13 21 7,0 p-z 8,7 16 5,3 e-q 9,0 19 6,3 k-u 9,0 28 AND 15 21 7,0 p-z 9,0 18 4,0 b-g 8,3 20 5,7 f-r 7,3 29 AND 16 21 7,0 p-z 8,7 18 3,7 a-e 9,0 21 6,3 l-w 7,0 30 AND 17 23 6,3 k-v 8,0 16 5,7 f-r 8,3 19 7,7 r-z 7,7 31 D.Złote 21 7,0 p-z 9,0 16 5,7 f-r 9,0 19 7,3 q-z 9,0 32 D.Amber 21 7,7 r-z 9,0 18 6,0 j-s 9,0 21 6,7 n-z 8,7 33 D.Agat 21 7,0 p-z 8.7 16 5,7 f-r 9,0 19 8,0 s-z 8,0 34 CHD 62 23 7,0 p-z 9,0 16 4,7 c-m 8,3 20 6,0 j-s 7,7 35 DC28 21 7,0 p-z 9,0 16 4,0 b-g 9,0 19 9,0 z 9,0 36 DC83 21 6,3 k-v 8,7 18 4,3 b-j 9,0 20 7,0 p-z 8,7 37 DC73 21 7,0 p-z 8,7 16 4,3 b-j 9,0 20 6,0 j-s 7,7 38 DC74 21 7,7 r-z 8,7 18 3,7 a-e 9,0 19 7,3 q-z 8,3 39 DC75 21 5,7 f-r 9,0 16 5,3 e-q 9,0 20 7,3 q-z 9,0 40 DC89 21 6,3 k-v 8,3 21 6,0 j-s 9,0 19 7,7 r-z 8,7 41 D.Diament 23 6,3 k-v 8,3 16 5,3 e-q 9,0 21 6,3 k-v 8,0 42 DL r-z 6R 23 7,0 p-z 8,0 21 6,7 n-z 8,3 21 6,7 n-z 8,3 43 MO03/10 21 7,0 p-z 8,7 18 4,3 b-j 9,0 20 7,7 r-z 8,3 44 Szk.1N/10 21 7,0 p-z 9,0 18 3,7 a-e 9,0 20 6,0 j-s 9,0 45 Szk.2N/10 21 7,0 p-z 9,0 18 3,3 a-d 9,0 20 6,0 j-s 9,0 21

46 Szk. 11/10 21 7,0 p-z 8,7 18 5,0 d-p 9,0 20 5,7 f-r 7,7 47 Szk. 12/10 21 7,7 r-z 9,0 16 3,0 a-c 9,0 19 7,3 q-z 8,7 48 Szk. 10/09 21 7,7 r-z 8,7 16 5,0 d-p 9,0 21 5,0 d-p 7,0 49 LO 558/09 21 7,7 r-z 8,7 21 5,7 f-r 9,0 20 7,7 r-z 9,0 50 LO 669/09 21 7,7 r-z 9,0 21 5,7 f-r 9,0 20 6,0 j-s 8,3 51 SR 20 21 6,3 k-v 8,7 21 6,7 n-z 7,7 19 9,0 z 7,0 52 SR 27 23 6,3 k-v 8,7 16 4,3 b-j 7,7 21 7,7 r-z 7,0 53 SR 28 21 7,0 p-z 8,3 21 4,7 c-n 7,7 21 8,0 s-z 7,0 54 SR 29 23 8,3 u-z 7,7 16 5,0 d-p 7,3 21 6,3 k-v 7,0 55 SR 30 21 7,0 p-z 8,3 21 6,0 j-s 8,3 20 7,7 r-z 7,0 56 SR 31 23 6,3 k-v 8,0 21 5,0 d-p 7,7 20 4,7 c-n 7,7 57 SR 32 21 7,0 p-z 8,7 18 4,3 b-j 7,0 22 6,7 n-z 7,0 58 SR 33 21 6,3 k-v 8,7 16 3,7 a-e 7,7 21 8,7 w-z 7,0 59 CSIN 328 23 7,0 p-z 2,7 16 4,7 c-n 2,7 22 3,0 a-c 2,0 60 CSIN 330 23 8,0 s-z 3,0 21 4,3 b-j 3,0 22 2,7 a-b 2,0 61 HRSM 10-4R 21 7,0 p-z 9,0 16 3,3 a-d 8,3 19 7,0 p-z 9,0 62 HRSM 20-4R 21 7,0 p-z 9,0 18 3,7 a-e 9,0 20 6,7 n-z 9,0 63 HRSM 41-4R 21 7,0 p-z 9,0 21 5,3 e-q 9,0 20 6,7 n-z 9,0 64 HRSM 22-4R 21 6,3 k-v 8,7 18 4,3 b-j 9,0 20 5,7 f-r 9,0 65 HRSM 33-4R 23 7,0 p-z 9,0 18 3,3 a-d 9,0 20 7,7 r-z 8,7 66 HRSM 37-4R 21 6,3 k-v 9,0 16 3,7 a-e 9,0 21 5,3 e-q 9,0 67 HRSM 44-4R 21 7,0 p-z 9,0 21 5,0 d-p 9,0 20 7,7 r-z 9,0 68 HRSM 45-4R 23 7,0 p-z 9,0 21 5,3 e-q 9,0 21 6,0 j-s 9,0 69 HRSM 46-4R 23 7,0 p-z 9,0 21 6,0 j-s 9,0 21 6,3 k-v 9,0 70 HRSM 47-4R 23 6,3 k-v 8,7 18 4,0 b-g 9,0 21 4,3 b-j 8,0 71 HRSM 48-4R 21 7,0 p-z 8,3 18 4,3 b-j 9,0 21 4,7 c-n 9,0 72 HRSM 49-4R 21 7,0 p-z 9,0 18 4,3 b-j 9,0 21 6,7 n-z 8,7 73 HRSM 50-4R 21 7,0 p-z 8,3 16 4,3 b-j 9,0 21 6,0 j-s 9,0 74 HRSM 51-4R 21 7,0 p-z 8,7 16 5,3 e-q 9,0 19 8,3 u-z 9,0 75 HRSM 52-4R 23 7,0 p-z 9,0 16 5,0 d-p 9,0 21 5,0 d-p 9,0 76 HRSM 53-4R 21 7,7 r-z 9,0 18 4,3 b-j 9,0 20 8,0 s-z 9,0 77 HRSM 55-4R 21 7,0 p-z 9,0 18 3,7 a-e 9,0 20 7,0 p-z 8,6 78 HRSM 56-4R 21 7,0 p-z 8,7 18 3,7 a-e 9,0 19 6,3 k-v 9,0 79 HRSM 57-4R 21 7,0 p-z 9,0 16 4,0 b-g 9,0 21 6,0 j-s 9,0 80 HRSM 58-4R 21 7,0 p-z 8,3 18 4,3 b-j 9,0 20 5,0 d-p 9,0 81 HRSM 59-4R 21 7,0 p-z 8,7 18 3,3 a-d 9,0 19 6,3 k-v 9,0 82 HRSM 60-4R 21 7,0 p-z 9,0 18 4,3 b-j 9,0 21 5,7 f-r 8,7 83 HRSM 61-4R 21 7,0 p-z 9,0 16 4,0 b-g 9,0 20 5,0 d-p 9,0 84 HRSM 62-3R 21 6,0 j-s 9,0 18 4,3 b-j 9,0 20 7,0 p-z 9,0 85 HRSM 63-3R 21 7,0 p-z 8,7 21 5,0 d-p 9,0 19 7,0 p-z 8,7 86 HRSM 64-3R 21 7,0 p-z 9,0 18 4,7 c-n 9,0 21 5,0 d-p 8,7 87 HRSM 65-3R 21 7,0 p-z 9,0 16 4,3 b-j 9,0 19 9,0 z 9,0 88 HRSM 66-3R 21 7,0 p-z 8,0 18 4,0 b-g 9,0 20 6,3 k-v 9,0 89 HRSM 67-3R 23 7,0 p-z 8,7 21 5,0 d-p 9,0 21 6,7 n-z 9,0 90 HRSM 68-3R 23 7,0 p-z 9,0 18 4,3 b-j 8,3 20 6,7 n-z 9,0 zakres 21-28 - - 16-25 - - 19-23 - - średnio - 7,1 C 8,2-4,7 A 7,9-6,2 B 7,4 x jednakowymi literami oznaczono wartości nie różniące się istotnie na poziomie 0,05%; Kolorami oznaczono genotypy: białym populacyjne i mieszanńca, żółtym restorery, zielonym męskopłodne, różowym męsko sterylne; 22

W kłosach żyta, obok dużych sklerocjów widocznych w okresie wegetacji (Fot. 2) występowały często małe sklerocja (Fot. 3), które można było obserwować dopiero po wykonaniu młocki. Dlatego oceny występowania przetrwalników dokonywano w zebranym plonie, w którym obok ziarna obecne były sklerocja patogena. Fot. 2. Kłos żyta z dużym przetrwalnikiem Claviceps purpurea Fot. 3. Różne wielkości przetrwalników C. purpurea i ziarniaki żyta (u góry z prawej strony) Wyniki analizy wariancji wskazują, że nasilenie występowania sporyszu zależało od genotypu żyta oraz od miejscowości. Między tymi dwoma czynnikami (AxB) występowała interakcja (Tab. 15). Tabela 15. Średnie kwadraty dwuczynnikowej analizy wariancji występowania sporyszu Żródło zmienności Stopnie swobody Średnie kwadraty Bloki Genotyp (A) Miejscowość (B) A x B 2 89 2 178 0,440 0,232** 19,224** 0,209** Błąd 538 0,119 ** P < 0,05 23

Najwięcej roślin z objawami sporyszu stwierdzono w Wiatrowie (Tabela 16). Sporysz występował tutaj na poletkach z 89 genotypami żyta na ogólną ich liczbę wynoszącą 90. Na roślinach 7 tych genotypów o numerach: 13, 14, 28, 43, 51, 73 i 81 zanotowano istotnie mniej sklerocjów niż dwóch genotypów o numerach: 59 i 70. W Choryni sporysz stwierdzono jedynie na poletkach z 32 genotypami żyta. Na roślinach tych genotypów żyta procenty masy sklerocjów w plonie ziarna nie różniły się w stopniu istotnym statystycznie. Tabela 16. Występowanie sporyszu na 90 genotypach żyta w roku 2012 Genotyp Procent masy sklerocjów w masie plonu ziarna x) nr symbol Wiatrowo Choryń Smolice 1 GRADAN F1 0,7658 w-x 0,0324 a-m 0,0638 a-q 2 WM 11R 0,2409 d-u 0,0000 a 0,0927 a-q 3 WM 18R 0,3174 l-w 0,0000 a 0,0219 a-l 4 WM 19R 0,1146 a-r 0,0037 a-d 0,0435 a-o 5 WM 20R 0,4097 p-x 0,0147 a-h 0,0000 a 6 WM 29R 0,8470 x 0,0000 a 0,0000 a 7 WM 30R 4,7258 y 0,0000 a 0,0000 a 8 WM 31R 0,0540 a-o 0,0000 a 0,0000 a 9 WM 32R 0,4853 r-x 0,0000 a 0,0370 a-n 10 WM 36R 0,2157 b-t 0,0000 a 0,0000 a 11 WM 37R 0,6987 u-x 0,0340 a-m 0,0104 a-h 12 WM 38R 0,0024 a-c 0,0000 a 0,0249 a-l 13 NS 857N/95 0,1761 a-t 0,0000 a 0,0050 a-e 14 NS 841N/00 0,2047 a-t 0,0000 a 0,0037 a-d 15 NS 765N/99 0,0854 a-q 0,0000 a 0,0000 a 16 NS 768N/00 0,1213 a-s 0,0000 a 0,0234 a-l 17 NS 839N/00 0,0815 a-q 0,0000 a 0,0000 a 18 NS 794N/00 0,2952 i-w 0,0000 a 0,0000 a 19 NSIN 596 0,0675 a-q 0,0000 a 0,0998 a-r 20 NSIN 1007 0,2196 b-t 0,0012 a-b 0,0178 a-j 21 NSIN 1008 0,2579 f-v 0,0000 a 0,0163 a-i 22 NSIN 1009 0,3051 k-w 0,0190 a-k 0,0823 a-q 23 NSIN 1012 0,1362 a-s 0,0118 a-h 0,0351 a-n 24 NSIN 1013 0,2317 c-u 0,0000 a 0,0451 a-o 25 NSIN 1023 0,0806 a-q 0,0163 a-i 0,0000 a 26 AND 12 0,1224 a-s 0,0161 a-i 0,0940 a-q 27 AND 13 0,1035 a-r 0,0000 a 0,0118 a-h 28 AND 15 0,1668 a-s 0,0077 a-g 0,0012 a-b 29 AND 16 0,2223 b-t 0,0063 a-f 0,0077 a-g 30 AND 17 0,7170 v-x 0,0077 a-g 0,0091 a-h 31 D.Złote 0,1786 a-t 0,0000 a 0,0578 a-o 32 D.Amber 0,1785 a-t 0,0000 a 0,0118 a-h 33 D.Agat 0,2522 e-v 0,0000 a 0,1265 a-s 34 CHD 62 0,1462 a-s 0,0063 a-f 0,0254 a-l 35 DC28 0,1184 a-r 0,0000 a 0,0292 a-l 36 DC83 0,7720 w-x 0,0000 a 0,0219 a-l 37 DC73 0,0833 a-q 0,0000 a 0,0788 a-q 38 DC74 0,1975 a-t 0,0024 a-c 0,0000 a 39 DC75 0,1038 a-r 0,0212 a-k 0,0744 a-q 40 DC89 0,1097 a-r 0,0091 a-h 0,0077 a-g 41 D.Diament 0,1974 a-t 0,0491 a-o 0,1307 a-s 24

42 DL 6R 0,2633 g-v 0,0000 a 0,0830 a-q 43 MO03/10 0,1584 a-s 0,0000 a 0,0024 a-c 44 Szk.1N/10 0,1563 a-s 0,0037 a-d 0,0289 a-l 45 Szk.2N/10 0,3509 n-x 0,0000 a 0,0281 a-l 46 Szk. 11/10 0,0269 a-l 0,0000 a 0,0000 a 47 Szk. 12/10 0,0892 a-q 0,0000 a 0,0063 a-f 48 Szk. 10/09 0,0782 a-q 0,0000 a 0,0351 a-n 49 LO 558/09 0,0677 a-q 0.0063 a-f 0,0000 a 50 LO 669/09 0,5235 s-x 0,0000 a 0,0625 a-p 51 SR 20 0,0535 a-o 0,0000 a 0,0037 a-d 52 SR 27 0,0228 a-l 0,0000 a 0,0000 a 53 SR 28 0,0234 a-l 0,0000 a 0,0000 a 54 SR 29 0,2046 a-t 0.0050 a-e 0,0104 a-h 55 SR 30 0,1969 a-t 0,0279 a-l 0,0163 a-i 56 SR 31 0,0782 a-q 0,0000 a 0,0000 a 57 SR 32 0,0104 a-h 0,0000 a 0,0653 a-q 58 SR 33 0,1447 a-s 0,0000 a 0,0309 a-l 59 CSIN 328 0,7965 w-x 0,1428 a-s 0,2597 f-v 60 CSIN 330 0,3430 m-x 0,0879 a-q 0,1474 a-s 61 HRSM 10-4R 0,0403 a-n 0,0000 a 0,0328 a-m 62 HRSM 20-4R 0,0000 a 0,0417 a-o 0,0104 a-h 63 HRSM 41-4R 0,0878 a-q 0,0000 a 0,0418 a-o 64 HRSM 22-4R 0,0556 a-o 0,0324 a-m 0,1107 a-r 65 HRSM 33-4R 0,1706 a-t 0,0000 a 0,0283 a-l 66 HRSM 37-4R 0,7761 w-x 0,0000 a 0,0403 a-n 67 HRSM 44-4R 0,1891 a-t 0,0077 a-g 0,0670 a-q 68 HRSM 45-4R 0,6052 t-x 0,0000 a 0,0624 a-p 69 HRSM 46-4R 0,0693 a-q 0,0000 a 0,0747 a-q 70 HRSM 47-4R 0,4159 q-x 0,0024 a-c 0,2699 h-v 71 HRSM 48-4R 0,3038 j-w 0,0012 a-b 0,1249 a-s 72 HRSM 49-4R 0,2525 e-v 0,0000 a 0,0279 a-l 73 HRSM 50-4R 0,1130 a-r 0,0000 a 0,0037 a-d 74 HRSM 51-4R 0,0736 a-q 0,0000 a 0,0370 a-n 75 HRSM 52-4R 0,0147 a-h 0,0104 a-h 0,0000 a 76 HRSM 53-4R 0,1391 a-s 0,0000 a 0,0324 a-m 77 HRSM 55-4R 0,0143 a-h 0,0000 a 0,0832 a-q 78 HRSM 56-4R 0,2508 e-v 0,0000 a 0,0631 a-p 79 HRSM 57-4R 0,2988 i-w 0,0000 a 0,0527 a-o 80 HRSM 58-4R 0,0572 a-o 0,0000 a 0,0382 a-n 81 HRSM 59-4R 0,0674 a-q 0,0077 a-g 0,0050 a-e 82 HRSM 60-4R 0,1424 a-s 0,0000 a 0,0443 a-o 83 HRSM 61-4R 0,1205 a-r 0,0000 a 0,0628 a-p 84 HRSM 62-3R 0,0834 a-q 0,0578 a-o 0,0350 a-n 85 HRSM 63-3R 0,1379 a-s 0,0000 a 0,0000 a 86 HRSM 64-3R 0,0175 a-j 0,0000 a 0,1131 a-r 87 HRSM 65-3R 0,4060 p-x 0,0037 a-d 0,0248 a-l 88 HRSM 66-3R 0,2359 c-u 0,0000 a 0,0492 a-o 89 HRSM 67-3R 0,7881 w-x 0,0000 a 0,0000 a 90 HRSM 68-3R 0,3653 o-x 0,0000 a 0,0675 a-q średnio 0,2743 T 0,0077 R 0,0410 S x jednakowymi literami oznaczono wartości nie różniące się istotnie na poziomie 0,05; Kolorami oznaczono genotypy: białym populacyjne i mieszańca, żółtym restorery, zielonym męskopłodne, różowym - męskosterylne; 25

W przeprowadzonym doświadczeniu sporysz wystąpił w największym stopniu w Wiatrowie (Tab. 16), gdyż tutaj kwitnienie żyta trwało najdłużej (Tab. 14). Miało to związek z najmniejszą obsadą roślin na poletkach w Wiatrowie (Tab. 12) oraz z przesunięciem kwitnienia na początek czerwca (w pozostałych dwóch miejscowościach kwitnienie rozpoczęło się o kilka dni wcześniej i zakończyło się w maju), kiedy wystąpiły opady deszczu i nastąpiło obniżenie temperatury średnio o 3,5 o C w porównaniu z temperaturą panującą w trzeciej dekadzie maja, co spowodowało opóźnienie zapylenia i wydłużenie kwitnienia. Nieco niższa średnia temperatura powietrza (o 0,2 o C) i wyraźnie większa suma opadów (o 14,6 mm) w trzeciej dekadzie maja w Smolicach niż w Choryni były przyczyną dłuższego kwitnienia żyta (Tab. 14) i większego występowania sporyszu (Tab. 16) w pierwszej niż w drugiej miejscowości. Celem prowadzonych prac było określenie zróżnicowania genetycznego populacji Claviceps purpurea pochodzących z poletek w Stacjach Hodowli Roślin i z pól produkcyjnych żyta oraz wyselekcjonowanie genotypów żyta odpornych lub najmniej podatnych na sporysz. Harmonogram prac w bieżącym roku sprawozdawczym był realizowany w ramach dwóch zadań: - ocena zróżnicowania genetycznego populacji Claviceps purpurea pochodzących z poletek w Stacjach Hodowli Roślin i z pól produkcyjnych żyta, - wyselekcjonowanie genotypów żyta odpornych lub najmniej podatnych na sporysz Wszystkie zaplanowane cele zostały osiągnięte. 7. Najważniejsze osiągnięcia Do najważniejszych osiągnięć należy zaliczyć: stwierdzenie wśród ocenianych 90 genotypów żyta dwóch grup tj. genotypów mniej i bardziej podatnych oraz braku genotypu nieulegającego w ogóle porażeniu przez C. purpurea; stwierdzenie istotnego wpływu warunków pogodowych na termin rozpoczęcia i czas trwania kwitnienia żyta oraz na występowanie sporyszu; wykazanie istnienia różnic w szybkości liniowego wzrostu grzybni poszczególnych izolatów C. purpurea, co może być jednym z czynników wskazujących na ich efektywność w zakażaniu kwiatów żyta; stwierdzenie większego zróżnicowania genetycznego populacji grzyba C. purpurea pochodzącej z poletek doświadczalnych Stacji Hodowli Roślin niż populacji wyodrębnionej z pól produkcyjnych północnej części Wielkopolski, co sugeruje znaczący wpływ genotypu gospodarza na zróżnicowanie patogena; opracowanie starterów użytecznych do analizy sekwencji genu β-tubuliny i wykazanie zróżnicowania w jej obrębie; ujawnienie zróżnicowania w konserwatywnym regionie rdna (ITS-1-5.8S-ITS2), co może być głosem w dyskusji na temat specjacji w obrębie C. purpurea. 8. Forma upowszechniania wyników Wyniki będą dostępne na specjalnej stronie internetowej: http://bip.puls.edu.pl 26

9. Wykaz prac opublikowanych w roku sprawozdawczym dotyczących realizowanego tematu Irzykowska L., Weber Z., Bocianowski J. 2012. Comparison of Claviceps purpurea populations originated from rye experimental plots and rye fields. Central European Journal of Biology 7(5): 839-849. 10. Wykaz prac złożonych do druku brak 11. Przyczyny ewentualnych odstępstw od harmonogramu zapisanego w karcie realizacji tematu brak 12. Informacja o wynikach współpracy naukowo technicznej krajowej i z zagranicą Ścisłe doświadczenie polowe realizowano w Stacjach Hodowli Roślin: - Poznańska Hodowla Roślin Spółka z o.o., Oddział Hodowli Roślin Wiatrowo - Danko Hodowla Roślin Spółka z o.o., Oddział Choryń - Hodowla Roślin Smolice Spółka z o.o., Grupa IHAR. 13. Udział w konferencjach zagranicznych W międzynarodowej konferencji naukowej odbywającej się w Holandii w dniach 1 do 5 października 2012 dotyczącej integrowanej ochrony roślin (IPM 2.0 Towards future proof crop protection in Europe) uczestniczył kierownik tematu, prezentując część uzyskanych w ramach projektu wyników. Ponieważ w integrowanej ochronie roślin bardzo ważne miejsce zajmuje hodowla i wprowadzanie do uprawy odpornych odmian, dlatego konferencja zainteresowała liczne grono naukowców z całego świata zajmujących się tymi zagadnieniami. Dla realizacji niniejszego tematu szczególnie duże znaczenie miał referat Prof. A. Tunen a z Holandii, a także przeprowadzona z nim rozmowa. Informacje przekazane w referacie i podczas dyskusji potwierdziły, że przy stosunkowo małych różnicach w podatności genotypów żyta na sporysz ograniczenie występowania tej choroby na odmianach żyta mieszańcowego firm działających na międzynarodowym rynku uzyskuje się przede wszystkim przez dobór restorerów wytwarzających przez długi okres, duże ilości pyłku. Wpływa to na skrócenie okresu kwitnienia i tym samym przyczynia się do ograniczenia występowania choroby. Najważniejszym wynikiem prowadzonych dyskusji dla realizacji tego tematu było wskazywanie, że wpływ warunków pogodowych niesprzyjających zakażeniu żyta przez C. purpurea (nie zależnie od zastosowanego sposobu inokulacji) i występowaniu sporyszu można zmniejszyć przez stosowanie zraszania roślin podczas kwitnienia. W związku z tym w najbliższym sezonie wegetacyjnym zaplanowane jest porównanie występowania sporyszu na poletkach z zastosowaniem i bez stosowania zraszania roślin podczas kwitnienia. W przypadku potwierdzenia korzystnego wpływu tego zabiegu na występowanie sporyszu, w przyszłości będzie można go powszechnie stosować przy ocenie podatności żyta na C. purpurea. Poznań, 29. 11. 2012 Zbigniew Weber 27