Zadanie 2.4 Poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego przez doskonalenie procesu gynogenezy oraz podnoszenie odporno

Transkrypt

1 Zadanie 2.4 Poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego przez doskonalenie procesu gynogenezy oraz podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów i tolerancji na suszę Wykonawcy: Dr hab. inż. Maria Gośka, prof. IHAR PIB Dr inż. Anna Litwiniec Dr inż. Barbara Skibowska Mgr inż. Sandra Cichorz

2 Cel badań: Celem zadania jest poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego do hodowli odmian dla zrównoważonych systemów rolniczych. Prace badawcze realizowane w tym kierunku obejmują doskonalenie procesu gynogenezy, podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów oraz tolerancji na suszę.

3 Zakres prac realizowanych w 2015 roku 1. Selekcja potencjalnych komponentów rodzicielskich (P0) o wysokim i niskim potencjale gynogenetycznym oraz ocena stopnia zróżnicowania genetycznego wybranych linii. 2. Utrzymanie cennych genotypów w kulturach in vitro, szklarni oraz polu. 3. Zastosowanie markerów molekularnych segregujących z odpornością (podatnością) na rizomanię, wyselekcjonowanych w toku uprzednio prowadzonych badań na materiałach dzikich buraków w celu oceny ich potencjalnej użyteczności w ocenie materiałów hodowlanych buraka cukrowego (reakcje PCR, HRM). 4. Wdrożenie reakcji PCR na wcześniejszych etapach porażania materiału wirusem nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka BNYVV zamiast standardowo stosowanego testu ELISA, w celu skrócenia cyklu hodowlanego w zakresie analiz początkowych. 5. Wybór wielonasiennych linii diploidalnych z poszczególnych typów użytkowych buraka cukrowego do zaplanowanego cyklu badań. 6. Założenie doświadczeń laboratoryjnych, ocena cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby.

4 Badania związane z doskonaleniem procesu gynogenezy z niezapłodnionych zalążków buraka cukrowego Etapy wzrostu buraków cukrowych przed izolacją zalążków

5 Regeneracja roślin z niezapłodnionych zalążków buraka

6 Nie można wyświetlić obrazu. Na komputerze może brakować pamięci do otwarcia obrazu lub obraz może być uszkodzony. Uruchom ponownie komputer, a następnie otwórz plik ponownie. Jeśli czerwony znak x nadal będzie wyświetlany, konieczne może być usunięcie obrazu, a następnie ponowne wstawienie go. Różnice morfologiczne haploidów uzyskanych z różnych zalążków jednej rośliny matecznej

7 Haploidy trzy tygodnie po kolchicynowaniu

8 Rozmnażanie podwojonych haploidów

9 Ukorzenianie podwojonych haploidów

10 Badania związane z podnoszeniem odporności na BNYVV Materiały badawczy do analiz obejmują materiały hodowlane dostarczone przez hodowców: 1 Homo RR RWD11 18, 2 - Homo RR RWD11 10, 3 - Homo RR RWD10 143, 4 - Homo RR RWD11 28, 5 - Homo RR RWD10 121, 6 - Homo RR RWD10 125, 7 - Homo RR RWD11 8, 8 - Homozyg rr FMS 07 1, 9 - Homozyg rr FMS 08 4, 10 - Hetero Rr FMS 07 1 x RWD10 125, 11 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 8, 12 - Hetero Rr FMS 071 x RWD , 13 - Hetero Rr FMS 084 x RWD11 28, 14 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 18, 15 - Hetero Rr FMS 071 x RWD10 121, 16 - Hetero Rr FMS 084 x RWD W bieżącym okresie rozliczeniowym dokonano oceny materiałów rodzicielskich z w/w (4 genotypy w poszczególnych obiektach oraz w próbach zbiorczych).

11 Z materiałów po pełnym okresie porażenia (8 tygodni) pobierano do analiz DNA oraz RNA liście oraz korzenie, odpowiednio. Izolacja DNA - metoda Davisa, RNA - metoda kolumienkowa. Odwrotna transkrypcja z zastosowaniem startera oligodt. Reakcje PCR z zastosowaniem wybranych uprzednio sekwencji prowadzono w następujących warunkach: 1ng/µl DNA, 2,5 mm MgCl 2 (Thermo Scientific), 0,2 mm dntp (Thermo Scientific), 1 µm specyficznych starterów (Genomed), 0,56 u DreamTaq Polymerase (Thermo Scientific), 1x Taq bufor z (NH 4 ) 2 SO 4 (Thermo Scientific) i woda PCR do 10 µl reakcji. Rozdział produktów reakcji na 1,5% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Dokumentacja żeli, szacowanie wielkości produktów (system dokumentacji - Gel Doc TM 2000, BIO-RAD; oprogramowanie - Quantity One, wersja 4.0.3). Analiza real-time PCR w module względnej analizy ilościowej z użyciem LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Applied Science), względem genu aktyny. Analiza HRM była prowadzona w module skanowania genu (LightCycler 480) z użyciem Luminaris Color HRM Master Mix (Thermo Scientific). Z zastosowaniem programu RestrictionMapper wersja 3 dokonano projektowania cięcia restrykcyjnego wybranych produktów PCR celem weryfikacji obecności wariantów sekwencyjnych (identyfikacja haplotypów wyodrębnionych w toku HRM). Produkty cięcia rozdzielano na 2,7% żelu agarozowym. Celem detekcji BNYVV oraz P. betae po skróconym okresie porażenia pobierano korzenie roślin po 1,5 oraz 1 miesiącu wzrostu roślin w ziemi zawierającej wirus i wektor. Następnie dokonano izolacji RNA oraz przeprowadzono odwrotną transkrypcję i PCR zgodnie z opisaną powyżej metodyką.

12 A) B1) Ryc.1. Ocena fenotypowa badanych materiałów po pełnym okresie porażenia z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna BNYVV względem genu aktyny.

13 Ryc.2. Ocena fenotypowa badanych materiałów po pełnym okresie porażenia z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna Polymyxa betae względem genu aktyny.

14 Ryc.3. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszącego Rz2.

15 Ryc.4. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszącego Rz1.

16 Ryc.5. Brak zróżnicowania badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszącego odporności.

17 Ryc.6. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP istotnego dla źródła Rz1.

18 A B Ryc.7. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszących różnym źródłom odporności, weryfikacja wybranych substytucji nukleotydowych z pomocą cięcia enzymami restrykcyjnymi.

19 A B Ryc.8. Zróżnicowanie poziomu BNYVV po skróconym okresie porażenia w badanych materiałach. A analiza po 1,5 miesiąca wzrostu roślin w warunkach porażenia, B analiza po miesiącu w warunkach porażenia.

20 A B Ryc.9. Zróżnicowanie poziomu BNYVV po skróconym okresie porażenia w badanych materiałach. A analiza po 1,5 miesiąca wzrostu roślin w warunkach porażenia, B analiza po miesiącu w warunkach porażenia.

21 Ryc.10. Obecność wybranych sekwencji specyficznych potencjalnie związanych z odpornością na rizomanię. Zgodnie z uprzednimi doniesieniami produkt o wielkości ok. 490 pz powstający w reakcji PCR może być związany z odpornością.

22 Badania związane z tolerancją na suszę Wysiano do pojemników po 100 nasion z sześciu różnych genotypów buraka cukrowego. Podczas wzrostu roślin w warunkach niedoboru wody zaobserwowano zwiększenie intensywności zabarwienia w części nadziemnej, prawdopodobnie w wyniku zwiększonej akumulacji chlorofilu. W doświadczeniu wysiano nasiona 2 linii typu 2xZ, 2 linii typu 2xN oraz wzorzec (odmiana Pewniak i Janosik). Doświadczenie z 6 obiektami w trzech powtórzeniach założono na początku września. Do wypełnionych glebą pojemników o wymiarach 60cm x 40cm x 14,2cm wysiano po 100 nasion z każdego obiektu. Jako czynnik przyjęto dwa poziomy wilgotności gleby. Przeprowadzono ocenę cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby. W badanym materiale obserwowano zróżnicowanie w wielkości blaszek liściowych oraz masy korzeni w zależności od genotypu. Stwierdzono, że genotypy typu cukrowego charakteryzowały się wyższą tolerancją na stres suszy niż genotypy typu normalnego. Masa części nadziemnej i podziemnej analizowanych roślin była wyższa w porównaniu do kontroli. Podczas wzrostu roślin w warunkach niedoboru wody zaobserwowano zwiększenie intensywności zabarwienia w części nadziemnej, prawdopodobnie w wyniku zwiększonej akumulacji chlorofilu oraz wyższą masę części podziemnej w porównaniu do kontroli.

23 Wymierne rezultaty 1. Uzyskano linie podwojonych haploidów buraka cukrowego z genotypów o różnym potencjale gynogenetycznym stanowiące materiał do badań w przyszłym roku. 2. Systemy markerów molekularnych ISSR oraz RAPD umożliwiły charakterystykę zróżnicowania genetycznego osobników matecznych należących do dwóch typów buraka cukrowego. 3. Opracowano i przetestowano 4 markery SNP do detekcji kluczowych polimorfizmów związanych z odpornością na rizomanię w badanych materiałach hodowlanych. 4. Wyselekcjonowano materiały o wysokim stopniu homozygotyczności pod względem badanych loci, jak również heterozygotyczne do dalszych prac. 5. Zidentyfikowano obecność przynajmniej dwóch różnych źródeł odporności w badanych populacjach. 6. Zastosowanie i dalsza optymalizacja wcześniejszej detekcji BNYVV oraz Polymyxa betae są istotne dla możliwości skrócenia cyklu selekcyjnego. Doskonalenie narzędzi fenotypowania umożliwia poszukiwanie nowych źródeł odporności poprzez selekcję szczególnie cennych obiektów. 7. Stwierdzono, że wstępna selekcja prowadzona na zróżnicowanym diploidalnym wielonasiennym materiale hodowlanym w typie cukrowym wskazuje na możliwości wyboru genotypów tolerancyjnych na stres suszy.

24 8. Wyniki uzyskane w toku prowadzonych prac będą stopniowo wdrażane do praktyki i/lub upowszechniane m.in. w postaci publikacji naukowych. W okresie sprawozdawczym uzyskano następujące wartości mierników (wartość uzyskana/wartość docelowa): liczba przebadanych linii i form roślin (pod względem użyteczności rolniczej, cech morfologicznych, technologicznych, odporności na stresy lub elementów struktury plonu): 64/64; liczba analiz cytologicznych, chemicznych, biochemicznych lub molekularnych form roślin uprawnych: 3200/3200; liczba publikacji, doniesień konferencyjnych, opinii lub raportów: 0/1.