Genetyka, materiały dla studentów Pielęgniarstwa

Transkrypt

1 Markery genetyczne: definicja Marker genetyczny jest to cecha, która może być wykorzystana do identyfikacji osobników lub gatunków. Cechy markerów genetycznych Monogeniczny: warunkowany przez jeden gen Polimorficzny: występują 2 łatwo rozróżnialne formy Stabilny: nie podlega wpływowi środowiska Markery genetyczne dały podstawę pod rozwój genomiki (analiza genomów), współczesnej hodowli roślin i zwierząt oraz wspomagają diagnostykę chorób u człowieka. Brak plejotropii: wpływa tylko na jedną cechę Prof. dr hab. Roman Zielinski 1

2 Markery genetyczne: typy markerów Rozwój technologii molekularnych umożliwił postęp w mapowaniu i analizie genetycznej gatunków użytkowych. Typy markerów genetycznych Morfologiczne: pierwsze mapy genetyczne tworzono na podstawie markerów morfologicznych, Enzymatyczne: np. D. melanogaster, umożliwiły rozwój genetyki jęczmień. populacyjnej dostarczając informacji o zmienności organizmów. Molekularne DNA: umożliwiły badanie organizacji genomów i ich ewolucji. Smart breeding to wykorzystanie markerów molekularnych w hodowli roślin i zwierząt, czyli hodowli wspomaganej markerami: MAS: ang. marker assisted selection. Markery DNA: markery oparte o PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) to replikacja in vitro, która umożliwia uzyskanie milionów kopii fragmentów DNA. PCR (ang. polymerase chain reaction) Składniki niezbędne do PCR: DNA, które jest matrycą dla replikacji; startery: krótkie fragmenty DNA, które inicjują reakcję; nukleotydy: budulec dla nowo powstałego łańcucha DNA; enzym termostabilna polimeraza DNA prowadząca replikację. Termocykler umożliwia szybkie zmiany temperatur zgodne z zadanym schematem. Jeden z pierwszych modeli termocyklerów Model pozwalający na analizę w czasie rzeczywistym (real time). Współczesny model z gradientem temperaturowym i grzejną pokrywą. PCR polega na powtarzaniu cykli ogrzewania i oziębiania mieszaniny reakcyjnej w celu manipulowania temperaturo-zależnymi procesami: denaturacją DNA i replikacją prowadzoną przez enzym. Prof. dr hab. Roman Zielinski 2

3 Markery DNA: markery oparte o PCR Reakcja PCR obejmuje denaturację DNA, przyłączanie starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA (elongacja). 1. Denaturacja: rozplecenie nici DNA, temp. 94 o C. Powielany fragment matryca DNA 2. Annealing: przyłączenie starterów, temp o C. 3. Elongacja (amplifikacja): wydłużanie łańcucha DNA, temp. 72 o C. Startery to jednoniciowe oligonukleotydy (10-25 bp), komplementarne do danego fragmentu DNA, umożliwiają przyłączenie polimerazy DNA Polimeraza DNA syntetyzuje nowy łańcuch komplementarny do matrycy wykorzystując nukleotydy zawarte w mieszaninie reakcyjnej. Specyfika reakcji zależy od temperatury przyłączania starterów, zbyt niska starter przyłącza się do sekwencji niekomplementarnych, zbyt wysoka starter się nie przyłączy. Markery DNA: markery oparte o PCR W wyniku pojedynczego cyklu PCR z każdej cząsteczki DNA powstają dwie nowe cząsteczki DNA. Rutynowo przeprowadza się cykli. Liczba kopii danej sekwencji DNA w reakcji PCR rośnie wykładniczo według wzoru 2 n (n: liczba cykli). Cykl Liczba kopii Powstałe cząsteczki DNA są matrycami w następnym cyklu W reakcji PCR wykorzystuje się odporną na wysoką temperaturę polimerazę z Thermus aquaticus (Taq) lub z T. flavus (Tfl). Prof. dr hab. Roman Zielinski 3

4 Etapy reakcji PCR: czas i temperatura Czas prowadzenia poszczególnych etapów waha się od 30 s do 150 s. Najdłuższy jest czas elongacji. Wstępna denaturacja: wstępne rozplecenie nici DNA: 94 o C przez 3-5 min. Jednorazowo, nie powtarza się w kolejnych cyklach cykli obejmujących: denaturację 94 o C przez s w zależności od metody; annealing czyli przyłączanie starterów o C w zależności od temperatury topnienia starterów przez s w zależności od metody; elongacja czyli wydłużanie łańcucha 72 o C przez s w zależności od metody. Końcowe procesy po zakończeniu wszystkich cykli: końcowe wydłużanie pozwala dosyntetyzować końcowe fragmenty DNA, 72 o C przez 5-10 min. w zależności od długości amplifikowanych sekwencji. 4 o C ustawia się po zakończeniu wszystkich reakcji, pozwala na pozostawienie prób w termocyklerze po zakończeniu reakcji. Warunki reakcji PCR: temperatura topnienia Temperatura topnienia DNA to temperatura, w której połowa cząsteczek jest zdenaturowana. Temperatura przyłączania starterów (annealing) zależy od temperatury topnienia. Dlatego projektując warunki reakcji PCR należy zacząć do określenia temperatury topnienia starterów. 5 AGCTAAGGCCTAGCGTAGCCT 3 Liczba nukleotydów: 21 Liczba nukleotydów z G+C: 12 Procent G+C: 57% Testowanie warunków przyłączania starterów na ogół zaczyna się od Tm +/- 5oC. Projektując startery należy je tak dobrać, aby ich temperatury topnienia nie różniły się znacząco. T m = (logna + ) + 41 G+C/długość 600/długość T m = (log0.05) + 41 x 12/21 600/21 T m = (-1.3) T m = o C Prof. dr hab. Roman Zielinski 4

5 Warunki reakcji PCR: składniki Do przeprowadzenia reakcji PCR niezbędna jest matryca DNA oraz elementy niezbędne do przeprowadzenia reakcji. Matryca DNA Matrycą jest DNA, który wyizolowany został z organizmu. Do reakcji dodaje się ng w zależności od metody. Startery Startery są niezbędne do zainicjowania reakcji replikacji in vitro. Są to krótkie, jednoniciowe odcinki DNA (10-25 bp). Startery projektuje się na podstawie sekwencji, która będzie amplifikowana. Startery powinny zawierać >50% zasad z GC. Stężenie starterów wynosi µm dntp (nukleotydy) Nukleotydy: ATP, GTP, CTP, TTP niezbędne do tworzenia DNA. Stężenie każdego wynosi 200 µm. Polimeraza DNA: U polimerazy TAQ (Thermus aquaticus) lub Tfl (T. flavus). Bufory Bufor dla polimerazy: 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 i 50 mm Tris-HCl, dostarczany z polimerazą jako roztwór 10x lub 20x stężony. MgCl 2 : mm, kofaktor polimerazy, podnosi specyfikę reakcji. Objętość µl, uzupełnia się wodą do ostatecznej objętości. PCR: przebieg reakcji 1. Próby przygotowane do reakcji PCR. 2. Umieszczenie prób w termocyklerze. 3. Programowanie warunków reakcji. 4. Reakcja PCR. 5. Rozdział prób na żelu agarozowym. 6. Obserwacja w świetle UV, dokumentacja. Prof. dr hab. Roman Zielinski 5

6 Markery DNA: PCR sekwencje unikalne Reakcja PCR pozwala powielić określony, unikalny fragment genomu pod warunkiem znajomości jego sekwencji. W reakcji PCR niezbędne są startery. Aby je zaprojektować konieczna jest znajomość sekwencji amplifikowanej. Reakcja PCR pozwala wykryć polimorfizm sekwencji unikalnych (genów) wynikający z mutacji w miejscach przyłączenia starterów. Jeżeli starter się przyłączy to zachodzi amplifikacja a na żelu obserwujemy prążek. Jeżeli zaszła mutacja to starter się nie przyłącza i nie zachodzi amplifikacja. Nie obserwujemy prążka na żelu. Obecność prążka jest cechą dominującą. Heterozygoty mają prążek. Reakcja specyficzna Reakcja niespecyficzna LolP1 LolP1-3 LolP1B Lhab Produkty reakcji PCR alergenów pyłkowych i białka fotosystemu I (Lhab) u Lolium. PCR umożliwia wykrycie polimorfizmu sekwencji unikalnych, co znajduje zastosowanie w diagnostyce i badaniach genetyczno-ewolucyjnych. Markery DNA: PCR sekwencje unikalne Reakcja PCR genu KatG u M. tuberculosis wykorzystywana jest do identyfikowania szczepów lekoopornych. Para starterów 8 Reakcja niespecyficzna, może świadczyć o mutacji i lekooporności szczepu. Produkty PCR otrzymane przy pomocy pary starterów KatG8. Gen KatG podzielono na 12 ~300-nukleotydowych fragmentów na podstawie występowania mutacji warunkujących oporność na izoniazyd. Startery dobrano tak aby były komplementarne do miejsc mutacji. Jeżeli mutacja występuje u danego szczepu to starter się nie przyłącza (brak komplementarności) i nie zachodzi amplifikacja. Prof. dr hab. Roman Zielinski 6

7 Markery DNA: PCR - sekwencje powtarzalne Mikrosatelity (SSR): 1-6 nukleotydowe sekwencje, które występują w tandenomych powtórzeniach (5-50 kopii) w wielu miejscach genomu. Powtórzenia sekwencji CTG. Allele różnią się liczbą powtórzeń CTG. Allel A 1 : 9 powtórzeń 5 CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG 3 3 GACGACGACGACGACGACGACGACGAC 5 Allel A 2 : 7 powtórzeń 5 CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG 3 3 GACGACGACGACGACGACGAC 5 Elektroforeza A 1 A 1 A 2 A 2 A 1 A 2 Polimorfizm wynika z różnej liczby kopii sekwencji w tandemie. Allele różnią się długością, a więc także ruchliwością na żelu. U heterozygot widoczne są oba allele kodominacja. Markery DNA: PCR - sekwencje powtarzalne Mikrosatelity (SSR) charakteryzują się wysoką częstością mutacji, co pozwala rozróżniać osobniki. Segregacja SSR (H06) w pokoleniu F 2 (L. perenne x L. multiflorum) L. loliaceum, 2. L. remotum, 3. L. persicum, 4. L. temulentum, 5. L. canariense, 6. L. edwardii, 7, 8. L. multiflorum, 9, 10, 11. L. perenne, 12. L. rigidum. Wzory SSR u limby. Mikrosatelity wykorzystywane są do oceny zróżnicowania genetycznego, śledzenia pokrewieństwa i dróg migracji. Prof. dr hab. Roman Zielinski 7

8 Markery DNA: PCR sekwencje powtarzalne U człowieka mikrosatelity są równomiernie rozmieszczone na wszystkich chromosomach. Stanowią one 3% genomu. Rozmieszczenie mikrosatelitów na chromosomach człowieka liczone jako stosunek par zasad (bp) w mikrosatelitach do milionów par zasad w chromosomie (Mbp). Rozmieszczenie mikrosatelitów w egzonach (niebieskie), intronach (czerwone) i regionach międzygenowych (żółte). W egzonach człowieka występują głównie powtórzenia 3- i 6-nukleotydowe. Ekspansja mikrosatelitów może być przyczyną chorób neurodegeneracyjnych. Subramanian et al Markery DNA: PCR sekwencje powtarzalne Większość mikrosatelitów (85%) człowieka występuje u blisko spokrewnionych gatunków. Procent sekwencji podobnych do sekwencji człowieka (czerwone) oraz procent mikrosatelitów w uliniowanych sekwencjach. Występowanie mikrosatelitów człowieka u kręgowców poza naczelnymi. Liczby wskazują u ilu gatunków dany procent sekwencji występuje. Konserwacja mikrosatelitów u kręgowców może wskazywać, że nie zawsze są one neutralnymi markerami nie mającymi wartości adaptacyjnej. Buschiazzo and Gemme 2010 Prof. dr hab. Roman Zielinski 8

9 Centre for Evolution, Genomics and Biomathematics, e-gene Prof. dr hab. Roman Zielinski 9