Zadanie 2.4. Wykonawcy: Dr hab. inż. Maria Gośka, prof. IHAR PIB Dr inż. Anna Litwiniec Dr inż. Barbara Skibowska Mgr inż.

Transkrypt

1 Zadanie 2.4 Poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego przez doskonalenie procesu gynogenezy oraz podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów i tolerancji na suszę Wykonawcy: Dr hab. inż. Maria Gośka, prof. IHAR PIB Dr inż. Anna Litwiniec Dr inż. Barbara Skibowska Mgr inż. Sandra Cichorz

2 Cel badań: Celem zadania jest poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego do hodowli odmian dla zrównoważonych systemów rolniczych. Prace badawcze realizowane w tym kierunku obejmują doskonalenie procesu gynogenezy, podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów oraz tolerancji na suszę.

3 Zakres realizowanych prac 1. Selekcja potencjalnych komponentów rodzicielskich (P0) o wysokim i niskim potencjale gynogenetycznym oraz ocena stopnia zróżnicowania genetycznego wybranych linii. 2. Wyprowadzenie populacji mapującej (F1) oraz utrzymanie cennych genotypów w kulturach in vitro, szklarni oraz na polu. 3. Zastosowanie markerów molekularnych segregujących z odpornością (podatnością) na rizomanię, wyselekcjonowanych w toku uprzednio prowadzonych badań na materiałach dzikich buraków w celu oceny ich potencjalnej użyteczności w ocenie materiałów hodowlanych buraka cukrowego (reakcje PCR, HRM). 4. Wdrożenie reakcji PCR na wcześniejszych etapach porażania materiału wirusem nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka BNYVV zamiast standardowo stosowanego testu ELISA, w celu skrócenia cyklu hodowlanego. 5. Wybór wielonasiennych linii diploidalnych z poszczególnych typów użytkowych buraka cukrowego do zaplanowanego cyklu badań. 6. Założenie doświadczeń laboratoryjnych, ocena cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby. 7. Oznaczenie parametrów jakości technologicznej korzeni buraka. 8. Wybór najlepszych pojedynków do rozmnożeń przez chów krewniaczy. 9. Zainicjowanie dwuletniego cyklu poprzez wysiew nowych linii oraz wysiew wybranych genotypów po pierwszej selekcji.

4 M K M M K M A B M K M M K M C D Ryc.1A-D. Produkty reakcji z przykładowymi starterami RAPD1-RAPD4. M marker wielkości; K kontrola negatywna; 1-10 analizowane linie buraka cukrowego.

5 M K M M K M A A B M K M M K C D Ryc.2A-D. Produkty reakcji z przykładowymi starterami ISSR1-ISSR4. M marker wielkości; K kontrola negatywna; 1-10 analizowane linie buraka cukrowego.

6 Dzięki przeprowadzonym reakcjom w obrębie badanych materiałów zdefiniowano właściwe dla danych linii wzory prążkowe. Określono obecność unikalnych prążków: - 1 dla typu cukrowego Na podstawie współwystępowania określonych prążków w produktach amplifikacji z analizowanymi matrycami wyznaczono współczynnik podobieństwa genetycznego oraz opracowano dendrogram.

7 Wartość współczynnika podobieństwa genetycznego wg Neia i Li dla linii buraka cukrowego Genotyp Wartość GS typ cukrowy 0,76 typ cukrowo-normalny 0,72 typ normalny 0,76 Średnia wartość GS dla wszystkich linii 0,73

8 Ryc.3. Dendrogram podobieństwa genetycznego analizowanych linii buraka cukrowego opracowany na podstawie metody UPGMA (analizy średnich połączeń) z zastosowaniem wybranych starterów ISSR i RAPD generujących największy polimorfizm.

9 Ryc.4. Wykres PCoA podobieństwa genetycznego 10 linii buraka cukrowego z zastosowaniem metody UPGMA (analizy średnich połączeń) na podstawie współczynnika Neia i Li z wykorzystaniem wybranych starterów ISSR i RAPD.

10 Badania związane z podnoszeniem odporności na BNYVV Materiały badawczy do analiz obejmują materiały hodowlane: 1 Homo RR RWD11 18, 2 - Homo RR RWD11 10, 3 - Homo RR RWD10 143, 4 - Homo RR RWD11 28, 5 - Homo RR RWD10 121, 6 - Homo RR RWD10 125, 7 - Homo RR RWD11 8, 8 - Homozyg rr FMS 07 1, 9 - Homozyg rr FMS 08 4, 10 - Hetero Rr FMS 07 1 x RWD10 125, 11 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 8, 12 - Hetero Rr FMS 071 x RWD , 13 - Hetero Rr FMS 084 x RWD11 28, 14 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 18, 15 - Hetero Rr FMS 071 x RWD10 121, 16 - Hetero Rr FMS 084 x RWD W bieżącym okresie rozliczeniowym dokonano oceny w/w materiałów wyjściowych i potomnych (4 genotypy w poszczególnych obiektach oraz dokonano samozapylenia wybranych materiałów).

11 Izolacja DNA - metoda Davisa, RNA - metoda kolumienkowa. Odwrotna transkrypcja z zastosowaniem startera oligodt. Reakcje PCR z zastosowaniem wybranych uprzednio sekwencji prowadzono w następujących warunkach: 1ng/µl DNA, 2,5 mm MgCl 2 (Thermo Scientific), 0,2 mm dntp (Thermo Scientific), 1 µm specyficznych starterów (Genomed), 0,56 u DreamTaq Polymerase (Thermo Scientific), 1x Taq bufor z (NH 4 ) 2 SO 4 (Thermo Scientific) i woda PCR do 10 µl reakcji. Rozdział produktów reakcji na 1,5% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Dokumentacja żeli, szacowanie wielkości produktów (system dokumentacji - Gel Doc TM 2000, BIO-RAD; oprogramowanie - Quantity One, wersja 4.0.3). Oczyszczenie wybranych produktów PCR/Odzyskanie wybranych produktów z żelu agarozowego/reamplifikacja, sekwencjonowanie i analiza typu BLAST. Analiza real-time PCR w module względnej analizy ilościowej z użyciem LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Applied Science), względem genu aktyny. Analiza HRM była prowadzona w module skanowania genu (LightCycler 480) z użyciem LightCycler480 High Resolution Melting Master (Roche Applied Science). Z zastosowaniem programu RestrictionMapper wersja 3 dokonano projektowania cięcia restrykcyjnego wybranych produktów PCR celem weryfikacji obecności wariantów sekwencyjnych (identyfikacja haplotypów wyodrębnionych w toku HRM). Produkty cięcia rozdzielano na 2,7% żelu agarozowym. Celem detekcji BNYVV oraz P. betae po skróconym okresie porażenia pobierano korzenie roślin po ok. 3-6 tygodniach wzrostu roślin w warunkach porażenia. Następnie dokonano izolacji RNA oraz przeprowadzono odwrotną transkrypcję i PCR zgodnie z opisaną powyżej metodyką. Dodatkowo optymalizowano metody jednostopniowej odwrotnej transkrypcji oraz LAMP (loop-mediated isothermal amplification).

12 Ryc.5. Ocena fenotypowa badanych materiałów po pełnym okresie porażenia z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna BNYVV względem genu aktyny.

13 Ryc.6. Ocena fenotypowa badanych materiałów po pełnym okresie porażenia z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna Polymyxa betae względem genu aktyny.

14 Ryc.7. Ocena fenotypowa badanych materiałów z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna względem genu aktyny. A) Krzywe amplifikacji BNYVV, B) krzywe amplifikacji P. betae, C) krzywe amplifikacji aktyny. A B C

15 Ryc.8. Ocena fenotypowa badanych materiałów z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna względem genu aktyny. A) BNYVV, B) P. betae. A B

16 A B Ryc.9. Zróżnicowanie poziomu BNYVV po skróconym okresie porażenia w badanych materiałach. A analiza po 1,5 miesiąca wzrostu roślin w warunkach porażenia, B analiza po miesiącu w warunkach porażenia.

17 A B Ryc.10. Zróżnicowanie poziomu BNYVV po skróconym okresie porażenia w badanych materiałach. A analiza po 1,5 miesiąca wzrostu roślin w warunkach porażenia, B analiza po miesiącu w warunkach porażenia.

18 Ryc.11. System prowadzenia reakcji umożliwiający wczesną i dokładną ocenę fenotypową oraz badanie rozwoju symptomów reakcji w warunkach porażenia.

19 A B C Ryc.12. Detekcja wybranych sekwencji. A detekcja wirusa i wektora po 3, 4 i 5 tygodniach wzrostu w warunkach porażenia, B zmienna ekspresja jednej z sekwencji w liściach/korzeniach, RT-PCR po 4 tygodniach od momentu zainicjowania porażenia, C po 5 i 6 tygodniach.

20 Ryc.13. Optymalizacja rozwiązań w zakresie odwrotnej transkrypcji oraz szybkiej czułej detekcji BNYVV.

21 Ryc.14. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja polimorfizmów (SNPs) towarzyszących różnym źródłom odporności.

22 A B Ryc.15. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszących różnym źródłom odporności, weryfikacja wybranych polimorfizmów z pomocą cięcia enzymami restrykcyjnymi.

23 Ryc.16. Obecność wybranych sekwencji specyficznych potencjalnie związanych z odpornością na rizomanię w badanych materiałach.

24 Ryc.17. Weryfikacja wybranych produktów PCR sekwencjonowanie oraz analiza typu BLAST.

25 A Ryc.18. Ocena genotypowa badanych materiałów detekcja SNP towarzyszącego Rz1. A z zastosowaniem HRM, B z zastosowaniem RFLP. B

26 A B Ryc.19. Ocena genotypowa badanych materiałów analiza HRM w regionie, w którym identyfikowano SNP towarzyszące Rz2.

27 Ryc.20. Zróżnicowanie badanych materiałów detekcja SNP towarzyszących Rz2 z zastosowaniem HRM. Zoptymalizowano detekcję wybranych różnicujących SNP.

28 Badania związane z tolerancją na suszę Prace badawcze w kierunku tolerancji na suszę prowadzone były na zróżnicowanym genetycznie materiale hodowlanym obejmującym diploidalne wielonasienne formy buraka cukrowego. Po przeprowadzeniu analizy laboratoryjnej materiałów hodowlanych w bieżącym roku wybrano 10 linii ojcowskich. Założono doświadczenia w warunkach kontrolowanych w pojemnikach wypełnionych glebą oraz w warunkach polowych, w których brały udział te same linie ojcowskie. Przyjęto dwa poziomy wilgotności gleby. Przeprowadzono ocenę cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby. Jeden genotyp typu cukrowego charakteryzował się wyższą tolerancją na stres suszy niż pozostałe genotypy typu normalnego i cukrowo-normalnego.

29 Badania związane z tolerancją na suszę Doświadczenie porównawcze Straszków

30 Badania związane z tolerancją na suszę Szkółka rozmnożeniowa Straszków W bieżącym roku wysadzono także korzenie buraka cukrowego po pierwszej selekcji na tolerancję na stres suszy w szkółce rozmnożeniowej. W okresie wegetacji w szkółce zostały przeprowadzone obserwacje fenotypowe roślin tj. pokoju nasienników oraz wyrównania terminu kwitnienia.

31 Badania związane z tolerancją na suszę Zbiór korzeni buraków przeprowadzono pod koniec drugiej dekady października. Po zbiorze określono plon korzeni oraz pobrano miazgę, w której oznaczono zawartość cukru, potasu, sodu oraz azotu α - aminowego na automatycznej linii Venema. Wartość użytkową poszczególnych linii typu 2xZ, typu 2xN, typu 2xZN oraz wzorca oszacowano na podstawie wyników doświadczeń polowych. Komponenty Plon korzeni t/ha Zawartość cukru w % Plon cukru t/ha Zawartość (mval/100g) K Na N-α-NH 2 Wzorzec 85,52 17,68 13,64 3,50 0,33 0,65 N - 1/17 73,40 18,53 12,20 4,12 0,46 0,95 N - 2/17 71,19 18,03 11,46 3,98 0,56 0,93 Z - 3/17 63,36 17,92 10,12 3,95 0,62 0,93 Z - 4/17 64,08 18,40 10,50 4,32 0,57 1,16 ZN - 5/17 71,00 18,21 11,43 4,39 0,61 1,03 ZN - 6/17 68,15 18,22 11,10 4,06 0,46 1,07

32 Wymierne rezultaty 2017 Uzyskano linie podwojonych haploidów buraka cukrowego z genotypów o różnym potencjale gynogenetycznym stanowiące materiał do badań w przyszłym roku. Systemy markerów molekularnych ISSR oraz RAPD umożliwiły charakterystykę zróżnicowania genetycznego osobników matecznych należących do trzech typów buraka cukrowego (zidentyfikowano produkty różnicujące). Po przeprowadzeniu oceny cech morfologicznych i użytkowych wybrano i zabezpieczono korzenie buraka cukrowego o wysokiej wartości użytkowej. Zebrano nasiona z genotypów rozmnożonych w szkółkach chowu krewniaczego, które stanowią materiał do dalszych prac badawczo-selekcyjnych. Selekcja prowadzona na zróżnicowanym diploidalnym wielonasiennym materiale hodowlanym wskazuje na możliwości wyboru genotypów tolerancyjnych na stres suszy (wyselekcjonowano ogólnie 2 genotypy).

33 Wymierne rezultaty 2017 Potwierdzono z zastosowaniem analizy typu BLAST znaczące dopasowanie sekwencji wybranych produktów PCR sekwencjonowanych do sekwencji analogów genów odporności (RGAs) dostępnych w bazach danych, (na poziomie 99%). Udoskonalono metodykę detekcji wybranych SNP, różnicujących badane materiały. Otrzymano nasiona z materiałów zdefiniowanych pod kątem wybranych różnicujących SNP. Z zastosowaniem zaprojektowanego systemu umożliwiającego wczesną detekcję BNYVV oraz metody RT-PCR oceniano zmiany ekspresji wybranych genów rośliny, które mogą być istotne dla rozwoju infekcji i interakcji z patogenami BNYVV/Polymyxa betae. Ponadto bazując na danych fenotypowych zidentyfikowano i zabezpieczono w kulturach in vitro materiały cenne, które mimo wysokiej zawartości wektora charakteryzowały się bardzo niską oznaczoną zawartością wirusa.

34 W okresie sprawozdawczym uzyskano następujące wartości mierników (wartość uzyskana/wartość docelowa): liczba przebadanych linii i form roślin (pod względem użyteczności rolniczej, cech morfologicznych, technologicznych, odporności na stresy lub elementów struktury plonu): 46/46; liczba analiz cytologicznych, chemicznych, biochemicznych lub molekularnych form roślin uprawnych: 2500/2500; liczba udoskonalonych metodyk: 1/1; liczba publikacji, doniesień konferencyjnych, opinii lub raportów: 3/3.