Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

Transkrypt

1 Ćwiczenie 4 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu Wstęp CYP2D6 kodowany przez gen występujący w co najmniej w 78 allelicznych formach związanych ze zmniejszoną aktywnością lub brakiem aktywności enzymatycznej, przy czym w populacjach kaukaskich główną przyczyną niedoboru aktywności CYP2D6 jest obecność alleli *3 (SNPframeshift), *4 (SNP-splicing defect) i *5 (delecja genu). Wśród osób rasy kaukaskiej około 1-7% ma wiele aktywnych kopii genu, odpowiedzialnych za znacznie zwiększoną, ultraszybką aktywność metaboliczną. Osoby wolno oraz ultraszybko metabolizujące różnią się 5-15 krotnie szybkością metabolizmu od osób homozygotycznych z dwoma allelami dzikimi. Zmienność genetyczna ludzkiego genomu może wynikać z różnic na poziomie pojedynczych nukleotydów (SNP) aż po aberracje chromosomowe (strukturalne, liczbowe). Badania oparte na technologii mikromacierzy pozwoliły na wykrycie różnorodnych i istotnych zmian genomu. Ok. 12% ludzkiego genomu wykazuje zmienność wynikającą z duplikacji, delecji lub innych kombinacji określanych jako zmiana liczby kopii CNV (ang. Copy Number Variation) (Rys. 1). CNV mogą mieć wpływ na poziom ekspresji genów, różnice fenotypowe a w konsekwencji choroby (zespoły mikrodelecji, mikroduplikacji). Rys. 1 Zmiany strukturalne DNA ( źródło: Estivill et al. [2007]PloS Genet October: 3[10]:e190) Dobrym narzędziem do określenia liczby kopii genu w badaj próbie DNA jest PCR w czasie rzeczywistym (QPCR). Analiza wykonywana jest w identyczny sposób, jak badanie ekspresji genów, z ty że matrycą w reakcji nie jest cdna, a genomowe DNA pacjenta. Wszystkie odmiany PCR w czasie rzeczywistym, niezależnie od metody detekcji, opierają się na tej samej zasadzie pomiaru przyrostu amplifikowanej matrycy. Po każdym cyklu PCR mierzony jest względny poziom fluorescencji (R) w określonym zakresie widma, odpowiadającym wybranemu fluorochromowi. W przypadku CYP2D6 analiza CNV pozwala na określenie występowania 1) delecji genu tzw. allela *5 oraz 2) duplikacji (*1x2) i multiplikacji genu (*1xn). 1

2 W analizie CNV przeprowadzane są równolegle w jednej próbie 2 reakcje PCR w czasie rzeczywistym - badanego genu oraz genu o znanej, stałej ilości kopii w genomie. Mieszanina reakcyjna składa się: z polimerazy, dntps, buforu swoistego dla polimerazy, barwnika referencyjnego ROX (barwnik reporterowy używany w celu normalizacji sygnału fluorescencyjnego - w przypadku stosowania aparatów AB), para starterów dla genu badanego oraz sonda TaqMan znakowana fluorochromem (np. FAM) para starterów dla genu referencyjnego, który w ludzkich komórkach diploidalnych zawsze występuje w liczbie 2 kopii (np. RNasa P) oraz sonda TaqMan znakowana innym fluorochromem (np. VIC) Rys. 2 PCR i detekcja badanego genu i referencyjnego w jednej próbie 2

3 Od zmierzonej wartości R odejmowany jest poziom tła, będącym średnim poziomem fluorescencji w początkowej fazie PCR (np cykl). Uzyskane w ten sposób wartości względnego wzrostu fluorescencji po każdym z cykli PCR ( Rn), proporcjonalne do ilości powstającego produktu PCR, nanoszone są na wykres. W przypadku prawidłowo wykonanej reakcji wykresy przedstawiają równoległe krzywe sigmoidalne o identycznym nachyleniu. Następnie program arbitralnie ustala linię progową (ang. threshold line), umieszczoną powyżej nieswoistych odchyleń Rn. Dla każdej z badanych próbek oznaczana jest C T (ang. cycle threshold) po których krzywa amplifikacji przecina linię progową. Im większa początkowa ilość matrycy, tym mniejsza wartość C T (Rys.3). Rys.3 Krzywa amplifikacji dwóch prób A i B. Następnym etapem jest określenie różnicy wartości różnicy C T dla genu badanego i genu referencyjnego w próbie badanej oraz analizowanej równolegle próbie kalibracyjnej próbie DNA o znanej ilości kopii genu badanego. C T (próba badana) = C T (gen badany w próbie badanej) - C T (gen referencyjny w próbie badanej) C T (próba kalibracyjna) = C T (gen badany w próbie kalibracyjnej) - C T (gen referencyjny w próbie kalibracyjnej) Uzyskane różnice ( C T ) dla próby badanej porównuje się z wartością C T uzyskaną dla próby kalibracyjnej (jednej z analizowanych prób, stanowiącej próbę odniesienia o znanej ilości kopii genu badanego): C T = C T (próba badana) - C T (próba kalibracyjna) 3

4 Metoda opiera się na założeniu, że w fazie logarytmicznej PCR w każdym cyklu liczba kopi amplikonu zwiększa się dwukrotnie (100% wydajność reakcji). Stąd: Względna liczba kopii genu (względna liczba kopii danej sekwencji w porównaniu do próby kalibracyjnej): RQ = 2 - CT liczba kopii genu = RQ n (n - liczba kopii genu ref. - zwykle dwie kopie) Jeśli C T = 0 oznacza to, że względna liczba kopii badanego genu w próbie badanej jest taka sama jak w kalibracyjnej (2 0 =1) Jeśli C T = około -0,6 oznacza to, że względna liczba kopii badanego genu w próbie badanej jest półtora razy większa niż w kalibracyjnej 3 kopie genu, duplikacja jednego allela (2 -(-0,6) =1,5) Jeśli C T = -1 oznacza to, że względna liczba kopii badanego genu w próbie badanej jest dwa razy większa niż w kalibracyjnej 4 kopie genu (2 -(-1) =2) Jeśli C T = 1 oznacza to, że względna liczba kopii badanego genu w próbie badanej jest dwa razy mniejsza niż w kalibracyjnej (delecja jednego z alleli) (2-1 =0,5) Jeśli C T = -2 oznacza to, że względna liczba kopii badanego genu w próbie badanej jest cztery razy większa niż w kalibracyjnej (2 -(-2) =4) Uwaga: Nie zawsze wydajność reakcji jest stuprocentowa. Wpływają na nią m.in. swoistość amplifikacji i sond, obecność inhibitorów (np. z procesu izolacji DNA), a także jakość stosowanych odczynników, szczególnie polimerazy. Np. Jeśli wydajność wynosi 70% to ilość kopii amplifikowanej sekwencji w każdym cyklu zwiększa się 1.7 x a nie 2 x, wówczas RQ = 1,7 - CT *n Wydajność można wyznaczyć przez sporządzenie krzywej standardowej przygotowanie PCR z użyciem jako matrycy seryjnych rozcieńczeń jednej z prób. (Kiedy rozcieńczymy dwukrotnie próbę wiemy, że jest tam dwa razy mniej kopii badanego genu: jeśli różnica wartości Ct pomiędzy tymi rozcieńczeniami wyniesie 1, oznacza to 100% wydajność reakcji, a różnica większa oznacza obniżoną wydajność reakcji potrzeba więcej niż jednego cyklu PCR, aby zwiększyć liczbę kopii dwukrotnie. próba badana próba, w której chcemy oznaczyć liczbę kopii; próba kalibracyjna wzorcowa, o znanej, wcześniej określonej liczbie kopii genu badanego; gen badany - np. CYP2D6, gen, którego liczbę kopii ustalamy; gen referencyjny taki, który zawsze występuje w tej samej liczbie kopii w każdej próbie DNA; 4

5 Ćwiczenie 4 - Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu Część praktyczna 0) Doprowadzenie DNA do odpowiedniego stężenia jest szczególnie ważne w przypadku analiz ilościowych (!) Należy rozcieńczyć próby do stężenia mieszczącego się w zakresie ng/ul np. jeśli stężenie wynosi 50 ng/ml, należy rozcieńczyć próbę 1:1 z wodą 1) Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej Skład mieszaniny TaqMan GE Master Mix TaqMan Copy Number Assay (CYP2D6) 20x TaqMan Copy Number Reference Assay (RNAseP), 20x Woda wolna od nukleaz Objętość [µl] 7,5 0,75 0,75 4,5 x ilość prób + 2 DNA (~20ng/µl) 1,5 Delikatnie wymieszaj, zwiruj i rozpipetuj mieszaninę po 13,5 µl do każdej probówki Następnie dodaj matrycę - 1,5 µl DNA. Tak przygotowane próby należy wstawić do termocyklera Applied 7500 Fast Real Time PCR System. Programowanie termocyklera: Typ eksperymentu: relative quantitification ( C T ) Badane sekwencje (targets): CYP2D6 (barwnik FAM) oraz RNAseP (barwnik VIC) Próba kalibracyjna: wzorzec zwierajuący 2 kopie CYP2D6 Gen referencyjny: RNAseP Objętość reakcji: 15 ul Program: Fast, 40 cykli 5