Zadanie 2.4. Cel badań:

Transkrypt

1 Zadanie 2.4 Poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego przez doskonalenie procesu gynogenezy oraz podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów i tolerancji na suszę Cel badań: Celem zadania jest poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego do hodowli odmian dla zrównoważonych systemów rolniczych. Prace badawcze realizowane w tym kierunku obejmują doskonalenie procesu gynogenezy, podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów oraz tolerancji na suszę.

2 Zakres prac realizowanych w 2016 roku 1. Selekcja potencjalnych komponentów rodzicielskich (P0) o wysokim i niskim potencjale gynogenetycznym oraz ocena stopnia zróżnicowania genetycznego wybranych linii. 2. Utrzymanie cennych genotypów w kulturach in vitro, szklarni oraz polu. 3. Zastosowanie markerów molekularnych segregujących z odpornością (podatnością) na rizomanię, wyselekcjonowanych w toku uprzednio prowadzonych badań na materiałach dzikich buraków w celu oceny ich potencjalnej użyteczności w ocenie materiałów hodowlanych buraka cukrowego (reakcje PCR, HRM). 4. Wdrożenie reakcji PCR na wcześniejszych etapach porażania materiału wirusem nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka BNYVV zamiast standardowo stosowanego testu ELISA, w celu skrócenia cyklu hodowlanego w zakresie analiz początkowych. 5. Wybór wielonasiennych linii diploidalnych z poszczególnych typów użytkowych buraka cukrowego do zaplanowanego cyklu badań. Założenie doświadczeń laboratoryjnych, ocena cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby. 6. Oznaczenie parametrów jakości technologicznej korzeni buraka. Wybór najlepszych pojedynków do rozmnożeń przez chów krewniaczy. Zainicjowanie dwuletniego cyklu poprzez wysiew nowych linii oraz wysiew wybranych genotypów po pierwszej selekcji.

3 Wyprowadzone linie homozygotyczne w kulturach in vitro z heterozygotycznych, wielonasiennych diploidalnych zapylaczy buraka cukrowego stanowiły materiał wyjściowy do badań nad potencjałem gynogenetycznym z zastosowaniem starterów ISSR oraz RAPD. Ponadto, sprawdzono czy wybrane systemy markerów molekularnych pozwolą na wytypowanie produktów charakterystycznych dla genotypów różniących się potencjałem gynogenetycznym. Analizowane materiały obejmowały 10 genotypów osobników matecznych należących do trzech typów buraka cukrowego: typ normalny, cukrowo-normalny, cukrowy. Na podstawie porównania współwystępowania określonych prążków w rozdziale elektroforetycznym po reakcji PCR z matrycami badanych genotypów w obecności najbardziej polimorficznych starterów wyznaczono współczynnik podobieństwa genetycznego wg Nei'a i Li (Nei i Li 1979), co z kolei pozwoliło na opracowanie dendrogramów metodą UPGMA (analizy średnich połączeń) łącznie dla starterów ISSR i RAPD i zilustrowanie odległości genetycznej między badanymi obiektami.

4 M K M M K M A B M K M M K M C D Produkty reakcji z przykładowymi starterami ISSR1-ISSR4. M marker wielkości; K kontrola negatywna; 1-10 analizowane linie buraka cukrowego.

5 M K M M K M A B M K M M K M C D Produkty reakcji z przykładowymi starterami RAPD1-RAPD4. M marker wielkości; K kontrola negatywna; 1-10 analizowane linie buraka cukrowego.

6 Dzięki przeprowadzonym reakcjom w obrębie badanych materiałów zdefiniowano właściwe dla danych linii wzory prążkowe. Na podstawie współwystępowania określonych prążków w produktach amplifikacji z analizowanymi matrycami wyznaczono współczynnik podobieństwa genetycznego oraz opracowano dendrogram. Wartość współczynnika podobieństwa genetycznego wg Neia i Li dla linii buraka cukrowego Genotyp Wartość GS typ cukrowy 0,60 typ cukrowo-normalny 0,70 typ normalny 0,63 Średnia wartość GS dla wszystkich linii 0,62

7 Dendrogram podobieństwa genetycznego analizowanych linii buraka cukrowego opracowany na podstawie metody UPGMA (analizy średnich połączeń) z zastosowaniem wybranych starterów ISSR i RAPD generujących największy polimorfizm.

8 Badania związane z podnoszeniem odporności na BNYVV W toku niniejszych prac prowadzono dalszą walidację oraz optymalizację detekcji markerów wyselekcjonowanych w poprzednim roku na osobnikach pokolenia F1 przy równolegle prowadzonej analizie fenotypu pod kątem porażenia BNYVV/Polymyxa betae (real-time PCR). Celem weryfikacji oraz identyfikacji polimorfizmów typu SNP związanych z różnymi źródłami odporności prowadzono sekwencjonowanie wybranych produktów PCR, analizy typu HRM oraz RFLP. Zaprojektowano detekcję kolejnych SNP występujących w badanych obszarach. Przeprowadzone analizy fenotypowe i genotypowe wskazują na obecność różnych źródeł odporności w badanych populacjach. Ze względu na pojawiające się zagrożenia przełamywania istniejącej odporności na rizomanię przez nowe patotypy wirusa poza genotypowaniem wskazana jest również optymalizacja procedur wczesnej oceny porażenia materiału. Dla weryfikacji możliwości wdrożenia takiego rozwiązania konieczne jest zbadanie rozwoju symptomów infekcji w czasie w warunkach porażenia. Zastosowano i zoptymalizowano system umożliwiający taką ocenę, w którym prowadzono analizę półilościową patogenów BNYVV oraz Polymyxa betae (RT-PCR), jak również analizę ekspresji wybranych produktów, które mogą wspomagać odporność.

9 A B C Względna analiza ilościowa BNYVV względem genu aktyny. A profil fluorescencja w cyklach reakcji dla BNYVV, B profil fluorescencja w cyklach reakcji dla aktyny, C wykresy słupkowe analizy względnej BNYVV/aktyna.

10 A B C Względna analiza ilościowa Polymyxa betae względem genu aktyny. A profil fluorescencja w cyklach reakcji dla P. betae, B - profil fluorescencja w cyklach reakcji dla aktyny, C wykresy słupkowe analizy względnej P. betae/aktyna.

11 A Zróżnicowanie badanych materiałów detekcja SNP towarzyszącego Rz1. A z zastosowaniem HRM, B z zastosowaniem RFLP. B

12 A B Zróżnicowanie badanych materiałów detekcja SNP towarzyszących Rz2 z zastosowaniem HRM. Ze względu na większą liczbę polimorfizmów A) zaprojektowano reakcje dla krótszego produktu B), a następnie wyniki weryfikowano przez sekwencjonowanie.

13 Badania związane z tolerancją na suszę Prace badawcze w kierunku tolerancji na suszę prowadzone były na zróżnicowanym genetycznie materiale hodowlanym obejmującym diploidalne wielonasienne formy buraka cukrowego w trzech typach użytkowych: typ cukrowy (Z), typ normalny (N) i typ cukrowo-normalny (ZN). Doświadczenie założono na początku kwietnia z 8 obiektami w trzech powtórzeniach. Jako czynnik przyjęto dwa poziomy wilgotności gleby. Przeprowadzono ocenę cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby. Jeden genotyp typu cukrowego charakteryzował się wyższą tolerancją na stres suszy niż pozostałe genotypy typu normalnego i cukrowo-normalnego.

14 Zbiór korzeni buraków przeprowadzono pod koniec drugiej dekady października. Po zbiorze określono plon korzeni oraz pobrano miazgę, w której oznaczono zawartość cukru, potasu, sodu oraz azotu α - aminowego na automatycznej linii Venema. Wartość użytkową poszczególnych linii typu 2xZ, typu 2xN, typu 2xZN oraz wzorca oszacowano na podstawie wyników doświadczeń polowych. Po określeniu wartości gospodarczej analizowanych linii wybrano po 50 korzeni buraka cukrowego z każdej linii, które zostały zabezpieczone w przechowalni w Staszkowie. Korzenie te zostaną wysadzone wiosną 2017 roku w szkółkach rozmnożeniowych dla uzyskania nasion do dalszych prac badawczych. Komponenty Plon korzeni t/ha Zawartoś ć cukru w % Plon cukru t/ha Zawartość (mval/100g) K Na Na Wzorzec 80,2 17,87 13,67 4,04 0,25 2,65 Z - 1 Z - 2 N - 3 N - 4 ZN - 6 ZN ,5 67,8 75,7 80,1 78,8 72,0 19,93 20,23 18,48 18,45 19,88 19,01 14,73 12,94 12,91 13,61 14,23 11,84 4,30 4,54 4, ,34 4,35 0,32 0,27 0,33 0,35 0,33 0,37 3,17 3,16 3,40 3,23 2,65 3,50

15 Podsumowanie 1. Uzyskano charakterystyczny prążek występujący wyłącznie u wszystkich osobników typu cukrowego, zaś nieobecny u pozostałych genotypów oraz prążek charakterystyczny dla typu normalnego. Nie zaobserwowano obecności produktów, które by w jednoznaczny sposób odróżniały genotypy o różnym potencjale gynogenetycznym. 2. Za pomocą sekwencjonowania ujawniono obecność dodatkowych polimorfizmów SNP w rejonie bliskim SNP dotychczas opisanym dla Rz2. Zaprojektowano startery pozwalające na uzyskanie krótszego produktu i jego analizę za pomocą HRM - zoptymalizowano metodę i wdrożono ją do praktyki laboratoryjnej. 3. Z zastosowaniem zaprojektowanych starterów oraz zoptymalizowanych procedur dokonano oceny genotypowej materiałów buraka cukrowego (F1), z których wybrane, zostały wprowadzone do kultur in vitro. Korzenie są jarowizowane. 4. Zaprojektowano system umożliwiający bardziej dokładny monitoring rozwoju porażenia BNYVV w roślinie i wczesną detekcję, już od 3 tygodnia, łącznie z optymalizacją izolacji RNA w tym systemie. Przy zastosowaniu metody RT-PCR zaobserwowano zmiany ekspresji wybranych genów rośliny, które mogą być istotne dla rozwoju infekcji i interakcji z patogenami BNYVV/Polymyxa 5. Wybrano i zabezpieczono korzenie buraka cukrowego o wysokiej wartości użytkowej oraz zebrano nasiona z genotypów rozmnożonych w szkółkach chowu krewniaczego, które stanowią materiał do dalszych prac badawczo-selekcyjnych. 6. Wstępna selekcja prowadzona na zróżnicowanym diploidalnym wielonasiennym materiale hodowlanym wskazuje na możliwości wyboru genotypów tolerancyjnych na stres suszy.

16 Miernik dla zadania Nazwa miernika Wartość bazowa Wartość docelowa liczba przebadanych linii i form roślin (pod względem użyteczności rolniczej, cech morfologicznych, technologicznych, odporności na stresy lub elementów struktury plonu) liczba analiz cytologicznych, chemicznych, biochemicznych lub molekularnych form roślin uprawnych liczba opracowanych lub udoskonalonych metodyk liczba publikacji, doniesień konferencyjnych, opinii lub raportów Wartość uzyskana (w nawiasie podać wartość osiągniętą tylko w 2016r.) Np (56) (2750) 0 1 1(1) 1 3 3(2)