Wydział Biologii UW Zakład Mikrobiologii Stosowanej ul. Miecznikowa 1 02-096 Warszawa Cytotoksyny wykorzystanie w biotechnologii i wakcynologii Prowadzenie i przygotowanie: Dr Tomasz Jagielski, mgr Katarzyna Roeske oraz dr Radosław Stachowiak Wstęp Zainteresowanie badaczy na świecie bakterią Listeria monocytogenes wynika przede wszystkim z faktu, iż bakteria ta jest podstawowym organizmem modelowym w badaniach nad mechanizmami bakteryjnej patogenezy oraz odpowiedzią immunologiczną 1. Określenie funkcji LLO (listeriolizyna hemolizyna L. monocytogenes) oraz znalezienie genu hly (gen strukturalny LLO) i innych genów kodujących determinanty patogenezy L. monocytogenes było możliwe dzięki izolacji i charakterystyce serii mutantów insercyjnych. Wszystkie mutanty pozbawione hemolizyny nie były zdolne do wzrostu wewnątrzkomórkowego w hodowlach tkankowych i były awirulentne dla myszy 2. Tak jak większość enteropatogenów L. monocytogenes w celu rozpoczęcia procesu chorobowego musi pokonać barierę nabłonka jelitowego. Komórki Listeria w procesie penetracji mogą podobnie jak inne enteropatogeny wykorzystać wyspecjalizowane komórki M występujące w nabłonku FAE pokrywającym kopuły kępek Peyera (Rys. 1) lub wnikać bezpośrednio przez komórki nabłonka wykorzystując jedną z adhezyn, internalinę A. Po przeniknięciu przez ochronne warstwy śluzu bakterie chorobotwórcze przylegają do zewnątrzkomórkowej matrix ssaków (ECM, mammalian extracellular matrix) występującej na powierzchni tkanki nabłonkowej gospodarza. Przezwyciężają w ten sposób mechaniczne systemy obronne występujące na powierzchni tkanek i inicjują kolonizację specyficznych nisz tkankowych. W większości zainfekowanych tkanek L. monocytogenes dociera do wnętrza komórek dzięki zdolności do indukcji fagocytozy (internaliny) przez komórki, które normalnie nie fagocytują. Dokładniejsze badania wykazały, że podczas infekcji ma miejsce szereg interakcji pomiędzy Rys. 1. Wnikanie L. monocytogenes do wnętrza kępki Peyera. bakterią, a komórką gospodarza. Inwazja komórek gospodarza 1 Ikonomidis G., Frankel F.R., Portnoy D.A., Paterson Y. 1995. Listeria monocytogenes: a novel live vaccine vector. Vaccines 13: 317-326. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2 Camilli A., Paynton C. R. and D. A. Portnoy. 1989. Intracellular methicillin selection of Listeria monocytogenes mutants unable to replicate in a macrophage cell line. Proc.Natl.Acad. Sci. USA 86: 5522-5526 1
rozpoczyna się od internalizacji komórki bakteryjnej na drodze fagocytozy w przypadku makrofagów lub indukcji fagocytozy w przypadku komórek normalnie niefagocytujących. Inwazja bakteryjna rozpoczyna się od otaczana bakterii błoną endocytoplazmatyczną. Proces wnikania do wnętrza komórki różni się od obserwowanego w przypadku infekcji Salmonella i Shigella marszczenia błony (ang. membrane ruffling) nazwanego mechanizmem trigger i został określony jako zipper. W tym przypadku zamykanie się błony nad bakterią przebiega łagodniej i przypomina zamykający się suwak. Zamknięcie komórek Listeria w fagosomie nie trwa długo gdyż bakteria bardzo szybko, już po około 30 minutach od rozpoczęcia wnikania wydostaje się z wakuoli. W ten sposób bakterie unikają strawienia, które jest naturalny procesem przebiegającym prawie natychmiast po połączeniu się fagosomu z lizosomem. Zdolność przenikania bakterii przez błony wakuoli jest uwarunkowana aktywnością hemolityczną 3. Głównym czynnikiem wirulencji L. monocytogenes jest białko hemolityczne - listeriolizyna O (LLO) należąca do cytolizyn zależnych od cholesterolu - CDC (Cholesterol Dependent Cytolysins), tej samej rodziny białek co streptolizyna O Streptococcus pyogenes i perfringolizyna O Clostridium Rys. 2. Cykl życiowy L. monocytogenes. perfringens. Charakterystyczną cechą LLO odróżniającą ją od reszty toksyn z rodziny CDC, unikalną zresztą również w skali wszystkich hemolizyn bakteryjnych jest niska aktywność w neutralnym ph z optimum aktywności w niskim ph. Dzięki tej właściwości LLO L. monocytogenes nie pozostaje długo zamknięta wewnątrz fagolizosomu. Insercja listeriolizyny wewnątrz błony wywołuje wytworzenie kanałów w błonie fagosomu, a w końcu rozpad błony fagosomu. Proces ten wspomagają dwie fosfolipazy: A i B. Ruch bakteri w cytoplazmie jest możliwy dzięki zjawisku kontrolowanej polimeryzacji filamentów aktynowych znajdujących się w cytoplazmie gospodarza. Odpowiedzialny za ten proces ze strony komórki bakteryjnej jest produkt genu acta. Zadaniem białka ActA jest organizacja kompleksów białkowych zawartych w komórkach gospodarza w celu pośrednictwa przy tworzeniu filamentów aktynowych na jednym z biegunów komórki bakteryjnej, dzięki którym Listeria jest efektywnie przesuwana w jednym kierunku. Powstaje charakterystyczna struktura, zwana kometą listeryjną, która umożliwia przemieszczanie się bakterii nawet do sąsiednich komórek w organizmie gospodarza. Po przejściu do sąsiedniej komórki L. monocytogenes zostaje zamknięta w podwójnej błonie fosfolipidowej jednej z komórki w której dotychczas przebywała i drugiej, do której właśnie przeniknęła. Ucieczka z podwójnej wakuoli jest odpowiednio trudniejsza o ile w przypadku pojedynczej czynnikiem niezbędnym, a zarazem wystarczającym jest sama LLO to liza podwójnej błony 3 Bielecki J., Youngman P., Connely P., Portnoy D.A. 1990. Bacillus subtilis expressing haemolysin gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells. Nature 345: 175-176 2
nie jest możliwa bez udziału fosfolipaz, w szczególności PlcB. Po ucieczce z podwójnej wakuoli patogen znajduje się w cytoplazmie sąsiedniej komórki i cykl się zamyka. Cykl obrazuje rys. nr 2. Jak zaznaczono na rys. 2, wiele bakterii ulega degradacji w fagosomie. Fakt ten ma również konsekwencje dla odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez L. monocytogenes. W przypadku profesjonalnych komórek prezentujących antygen (ang. Antigen Presenting Cells - komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty B) obce białka poddane działaniu enzymów proteolitycznych obecnych w fagosomie, przyłączają się do rowka wiążącego antygen cząsteczki MHC (ang. Major Histocompatibilty Complex) - układu zgodności tkankowej, który dotej pory był zablokowany przez peptyd CLIP (class II-associated peptide). Po czym cząsteczki są transportowane na powierzchnie komórki i prezentowane w kompleksie zgodności tkankowej klasy II (MHC II). Prowadzi to do aktywacji limfocytów T pomocniczych (CD4+), które pomagają ograniczyć Rys. 3. Szlaki prezentacji antygenów. postęp infekcji, gdyż wspomagają zarówno odpowiedź humoralną (produkcja przeciwciał przez limfocyty B i aktywacja układu dopełniacza) i odpowiedź komórkową przez stymulację limfocytów T. Najbardziej charakterystycznym efektem infekcji L. monocytogenes jest wysoce wydajna aktywacja limfocytów CD8 które są niezbędne do eradykacji infekcji. Cecha a ma pierwszorzędne znaczenie w licznych projektach wykorzystania tej bakterii jako szczepionki, które zostaną przedstawione w kolejnych rozdziałach. Cytolizyna warunkuje uwolnienie bakterii do cytozolu, a wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii powoduje prezentacje białek patogena na powierzchni komórki przy udziale MHC klasy I oraz indukcje specyficznych limfocytów T cytotoksycznych. Białka (antygeny) wydzielane przez obecne w cytozolu komórki Listeria ulegają proteolizie przez cytoplazmatyczne enzymy. Umożliwia to dostarczenie dostarczenie rozpuszczalnych antygenów do TAP - zależnego szlaku cytoplazmatycznego (Transporter Associated with antigen Processing), dostarczenie ich do retikulum endoplazmatcznego i w konsekwencji prezentację antygenu w kompleksie z MHC I co może prowadzić do generowania limfocytów CD8+ przeciw antygenom wydzielanym przez wewnątrzkomórkową L. monocytogenes. Ilustruje to rys. 3. Powyżej przedstawiony właściwości L. monocytogenes sprawiają, że jest on idealnym kandydatem na szczepionkę nowej generacji, zdolnej do indukcji odpowiedzi komórkowej. Zalety L. monocytogenes jako szczepionki można podsumować w następujących punktach: Indukcja odpowiedzi komórkowej Infekcja APC Niska częstość zakażeń w populacji Łatwość manipulacji genetycznych Bezpieczeństwo Stabilność Ekonomiczna 3
Naturalnie zastosowanie każdego organizmu patogennego jako szczepionki wymaga jego atenuacji. Alternatywą jest zastosowanie bakterii niepatogennej, która nabywa w pewnym stopniu zdolności inwazyjnych dzięki sklonowaniu wybranych determinant patogenezy. Taki proces jest swego rodzaju odwrotnością atenuacji. B. subtilis zawierający wklonowany do kasety SPAC gen kodujący hemolizynę L. monocytogenes (Rys. 4) stał się zdolny do wniknięcia do wnętrza komórek eukariotycznych. Wprowadzenie jednego obcego genu umożliwia komórkom Bacillus dostanie się do cytoplazmy i przeżycie w tym całkowicie obcym środowisku. Do wnętrza kasety SPAC można doklonować następne konstrukcje genetyczne umożliwiające wydzielanie przez bakterie znajdujące się wewnątrz cytoplazmy dodatkowych białek. Tak skonstruowany szczep bakteryjny staje się biologiczną strzykawką, nośnikiem służącym do indukcji oporności typu komórkowego skierowanej przeciwko dowolnemu organizmowi Rys. 4. Mapa fizyczna sekwencji zintegrowanych w chromosomie B. subtilis umożliwiających ekspresję listeriolizyny O pod kontrolą indukowanego przez IPTG promotora p spac. pbr- sekwencje pochodzące z plazmidu pbr322; Tn- sekwencje pochodzące z transpozonu Tn 917; strzałka ciągła oznacza konstytutywną transkrypcję z promotora p. pcn ; strzałka przerywana oznacza transkrypcję z promotora p. spac indukowaną obecnością IPTG. patogennemu. Przedstawiony system immunizacyjny wykorzystujący B. subtilis jest wysoce bezpieczny ponieważ: szczep jest niesporogennym mutantem delecyjnym nie posiadającym zdolności do wzrostu poza środowiskiem laboratoryjnym, wprowadzone geny znajdują się w zintegrowanej z bakteryjnym chromosomem kasecie SPAC, są one pod silną i ścisłą kontrolą. Szczep wykorzystywany do immunizacji powinien zawierać wkolowany w kasecie SPAC gen kodujący LLO i białko przeciwko któremu miała by powstać odpowiedź immunologiczna organizmu. Konstrukcje genetyczne wytwarzane w naszym laboratorium posiadają dodatkowo kopie innych białek biorących udział w przebiegu procesu patogenezy Listeria. W celu zwiększenia wydajności internalizacji komórek Bacillus subtilis do wnętrza tkanki nabłonkowej do konstrukcji pag58hly doklonowano następne geny Listeria. Dalsze prace przeprowadzone w naszym laboratorium pozwoliły rozszerzyć rodzinę plazmidów pag58hly. Otrzymano konstrukcje np. eksprymujące listeryjną hemolizynę i fosfolipazę. Uzyskany zestaw konstrukcji genetycznych pozwoli zbadać współdziałanie determinant procesu patogenezy Listeria, umożliwi zbadanie wpływu eksprymacji hemolizyny i fosfolipazy na komórki eukariotyczne. Reakcje PCR (PCR, ang. polymerase chain reaction) umożliwiają wyizolowanie z masy DNA chromosomalnego bakterii pojedynczych genów i uzyskanie ich w dużej ilości. PCR czyli łańcuchowa reakcja polimeryzacji jest metodą powielania łańcuchów DNA in vitro, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Istotną zaletą tej techniki jest fakt, że wybrany do powielania segment DNA nie musi być oddzielony od reszty genomowego DNA przed rozpoczęciem amplifikacji. Po powieleniu segment z łatwością daje zwizualizować dzięki elektroforezie na żelu agarozowym. Do środowiska reakcji 4
wprowadzamy matrycowy DNA chromosomalny badanego szczepu, trifosforany deoksyrybonukleotydów, primery zawierające sekwencje flankujące interesujące nas geny oraz termostabilną polimerazę (np. polimeraza Taq pochodzącą z bakterii Termofilus aquaticus). W wyższej temperaturze pękają wiązania wodorowe, i podwójna helisa rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej do każdego łańcuch przyłączają się primery i każdy łańcuch dobudowuje sobie drugi komplementarny dołączając odpowiednie nukleotydy. Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej molekuły otrzymalibyśmy 2 n molekuł. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie zmienia faktu że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w diagnostyce klinicznej (wykrywanie L. monocytogenes poprzez amplifikację genu hly), klonowanie genów (przeniesienie genu hly z L. monocytogenes do B. subtilis) oraz kontroli GMO (w analizowanym przypadku wykrywanie zrekombinowanego szczepu B. subtilis, niosącego gen hly). Przebieg ćwiczenia Podczas ćwiczeń studenci izolują próbkę DNA chromosomowego zrekombinowanych szczepów Bacillus subtilis i przygotowują PCR na matrycy uzyskanego preparatu DNA (dzień I.), a następnie mierzą aktywność hemolityczną badanych szczepów (dzień II.). Materiały i metody Szczepy bakterii: 979 - B. subtilis MB4 (wt -kontrola), BR1S - B. subtilis pag/hly Dzień I. Izolacja DNA chromosomowego B. subtilis i PCR Izolacja DNA chromosomowego B. subtilis (przygotowują prowadzący dzień wcześniej) 1. Założyć hodowlę nocną B. subtilis (praca grup studenckich) 1. Zwirować 1,5 ml nocnej hodowli bakterii (8 tys. RPM / 5 min.) 2. Zlać supernatant, usunąć resztki supernatantu przy pomocy pipety 3. Osad zawiesić w 0,5 ml 0,1 x SSC 4. Zwirować jak w pkt. 1. 5. Zlać supernatant, osad zawiesić w 0,1 ml roztworu Lys (zawiera lizozym) 6. Inkubować 30-60 min. w temperaturze 37 o C 7. Dodać 0,2 ml roztworu LT i 20 µl roztworu Proteinazy K (pk) 8. Całość wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37 o C 9. Przenieść próbkę do 75 o C i inkubować 5 min. 10. Próbkę intensywnie worteksować 20 sek. 11. Wirować 3 min. przy 14 tys. RPM 12. Pobrać supernatant i nanieść na kolumnę do oczyszczania genomowego DNA 13. Wirować 1 min. przy 14 tys. RPM 14. Wyjąć minikolumnę z probówką i dodać do kolumny 0,5 ml roztworu płuczącego A1 15. Wirować 1 min. przy 14 tys. RPM 16. Przenieść kolumnę do nowej probówki à 2 ml i dodać do kolumny 0,4 ml roztworu A1 5
17. Wirować 2 min. przy 14 tys. RPM 18. Osuszoną kolumnę umieścić w nowej probówce à 1.5 ml i do złoża na dnie kolumny dodać 0,1 ml buforu Tris (10 mm Tris.HCl; ph 8.5) uprzednio ogrzanego do temperatury 75 o C 19. Inkubować próbkę przez 5 min. w temperaturze pokojowej 20. Wirować 1 min. przy 14 tys. RPM 21. Minikolumnę usunąć, a preparat oczyszczonego DNA użyć do nastawienia PCR Przygotowanie PCR (praca jałowa!): Do jałowej mini-probówki dodać: 16 µl jałowej wody dejonizowanej (H 2 O) 2 µl buforu (B) 0,4 µl dntps 0,5 µl startera prawego prhly2200 (2 µm) 0,5 µl startera lewego plhly2200 (2 µm) 0,1 µl polimerazy Taq (POL) 0,5 µl preparatu chromosomowego DNA Dzień II. Analiza produktu reakcji PCR (z dnia I.) 1. 10 µl produktu PCR przenieść do nowej probówki 1. dodać 2 µl barwnika 2. Próbki nanieść do dołków 3. Nałożyć wzorzec (5 µl) 4. Próbki rozdzielić na 0,7% żelu agarozowym 5. Żel barwić w roztworze bromku etydyny o stężeniu 10 µg x ml -1 6. Sporządzić dokumentację fotograficzną rozdziału DNA 6
Określenie aktywności hemolitycznej supernatantu pohodowlanego Wykonanie testu: 1. Przygotowanie krwi: 0,2 ml krwi baraniej zawiesić w 0,8 ml PBS o odpowiednim ph, zwirować (1200 RPM, 5 min., 4 o C), odrzucić supernatant, krwinki zawiesić w PBS (dodać PBS do objętości 1 ml); płukanie powtórzyć jeszcze dwukrotnie - wykonać łącznie 3 wirowania. 2. Przygotowanie próbek do testu (każda próba i kontrole w 3 powtórzeniach) 880 µl (lub 800 µl) PBS + 100 µl zawiesiny erytrocytów w PBS, preinkubować w 37 o C przez 15 min. 3. Do próbek (z pkt. 2.) dodać po 20 µl (lub 100 µl) otrzymanego supernatantu, SDS 0,5% (kontrola+), wody (kontrola-) i inkubować w 37 o C przez 30 min. 4. Przygotować probówki eppendorfa do rozcieńczeń (rozpipetować po 900 µl wody) 5. Po 30 min. zwirować próbki (1,2 tys. RPM, 5 min.) 6. 100 µl supernatantu rozcieńczyć 10x w odpowiednich probówkach eppendorfa. 7. Zmierzyć absorbancję przy 410 nm. (próba ślepa = kontrola-) 8. Obliczenie aktywności w jednostkach hemolitycznych [HU, ang. haemolytic units] przy następujących założeniach: absorbancja kontroli - = 0 HU, absorbancja kontroli+(sds)= 100 HU 7