WYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI

Transkrypt

1 ĆWICZENIE IV Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak WYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI Wstęp Rodzaj Listeria należy do typu Firmicutes wspólnie z rodzajem Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus oraz Clostridium. Listeria monocytogenes, główny przedstawiciel tego rodzaju, jest jednym z sześciu gatunków należących do tego rodzaju. Pozostałe gatunki to: L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri oraz L. grayi. Wśród wyżej wymienionych gatunków tylko dwa są patogenne i są to: L. monocytogenes będący patogenem zarówno ludzi jak i zwierząt oraz L. ivanovii infekująca zwierzęta, głównie owce i bydło. Pojawiają się również nieliczne raporty, w których opisywane są przypadki listeriozy u ludzi wywołanej przez L. ivanovii i L. seeligeri. L. monocytogenes to mała (0,5-2 μm długości i 0,4-0,5 μm szerokości) gramdodatnia ieprzetrwalnikująca pałeczka, wykazująca tendencję do polimorfizmu. W zakresie temperatur o C bakteria ta jest zdolna do ruchu przy pomocy rzęsek. Jednak w temperaturze 37 o C produkcja flageliny (białka budującego rzęskę) jest ograniczona, co powoduje brak zdolności poruszania się Bakteria ta jest względnym tlenowcem. Jest katalazo-dodatnia, oksydazoujemna. Wytwarza również β hemolizynę tworzącą strefy przejaśnienia na krwawym agarze L. monocytogenes jest bakterią powszechnie bytującą w środowisku naturalnym. Występuje w glebie, wodzie, roślinach, ściekach, w przewodach pokarmowych wielu gatunków zwierząt domowych i dzikich. Drobnoustrój ten rośnie w bardzo szerokim zakresie temperatur (1-45 o C), ph (4,3-9,6), toleruje wysokie stężenia soli (do 10%) i niską aktywność wodną 0,83. Konsekwencją powszechnego występowania tego mikroorganizmu w środowisku, jego relatywnie wysokiej odporności na czynniki fizyko-chemiczne, a także wyjątkowej w świecie bakterii zdolności nie tylko do przeżycia, ale również do namnażania się w szerokim zakresie temperatur, jest jego obecność w surowcach zwierzęcych i roślinnych oraz produktach spożywczych. Szacuje się, że 99% przypadków listeriozy u ludzi jest spowodowanych spożyciem żywności zanieczyszczonej tym drobnoustrojem. Częsta obecność L. monocytogenes w żywności w połączeniu z wysoką śmiertelnością w wyniku infekcji wywołanej przez ten patogen (sięgającą od 20 do 30%) zdecydowanie wyróżnia listeriozę spośród innych zatruć pokarmowych i stanowi poważny publiczny problem zdrowotny. Celem ćwiczenia jest wykrycie obecności bakterii z rodzaju Listeria, w tym L. monocytegens w różnych rodzajach żywności zgodnie z procedurą opisaną w normie Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Listeria monocytogenes PN EN ISO /A1:2005. Metoda wykrywania obecności Wykrywanie obecności L. monocytogenes w próbkach żywności obejmuje kilka etapów: I. Wstępne namnażanie w płynnej pożywce pół-selektywnej bulion pół-fraser II. Namnażanie wtórne w płynnej pożywce selektywnej bulion Fraser III. Różnicowanie na podłożach agarowych agar ALOA, agar Palcam lub Oxford IV. Identyfikacja na podstawie testów biochemicznnych

2 I. Schemat badania 1. Odważyć odpowiednią naważkę badanej próbki żywności. 9 x pożywki płynnej selektywnej Próbka badana ( x g lub x ml ) bulion pół Frasera podczas inkubacji zaczernienie pożywki (inkubacja 30 C, 24 godz.±2) 0,1 ml hodowli ml bulion Frasera (inkubacja 37 C, 48 ± 2 godz) 3. Agar Oxford lub Palcam Agar ALOA Agar ALOA Agar Oxford lub Palcam Posiew Agar ALOA - inkubacja w 37 C przez 24 godz.±3 do 48 godz.±3 Agar Oxford lub Palcam inkubacja w temperaturze zalecanej przez producenta przez 24 godz.±3 do 48 godz.±3 agar ALOA zielononiebieskie kolonie otoczone mętną strefą lub nie agar Oxford - kolonie szare, otoczone strefą zaczernienia, 1mm średnicy, po 48 godz. ciemnoszare z zielonkawym odcieniem, pępkowate zagłębienie z wyraźną strefą zaczernienia wokół kolonii. agar Palcam kolonie małe lub bardzo małe, oliwkowozielone lub szarozielone, czasami z czarno zabarwionym środkiem, zawsze z czarną otoczką. Po 48 godz. zielone kolonie, średnicy od 1.5 mm do 2 mm z charakterystycznym wgłębieniem w środku. 4. Testy potwierdzające Z każdej pożywki agarowej pobrać po 1 podejrzanej kolonii Posiew rysowy na podłoże agarowe TSYEA (inkubacja 37 C, godz. ) kolonie wypukłe, bezbarwne, nieprzezroczyste

3 4.1 Testy potwierdzające dla Listeria sp. Katalaza - dodatnia TSYEA Barwienie Grama - G +, cienkie, krótkie pałeczki Zdolność ruchu (inkubacja 25 C, 8 24 godz.) do zmętnienia pożywki Wykrywanie katalazy Pobrać pełne oczko hodowli wyrosłej na TSYEA i zawiesić w kropli roztworu nadtlenku wodoru na czystym szkiełku mikroskopowym. Wynik testu jest dodatni, jeżeli w ciągu 30 s pojawią się pęcherzyki gazu. Kontrola dodatnia - Staphylococcus aureus Kontrola ujemna Enterococcus faecalis Test na wykrywanie zdolności ruchu Posiew kłuty, za pomocą igły inokulacyjnej agaru półpłynnego materiałem pobranym z pożywki TSYEA. Posiewy inkubować w cieplarce w temperaturze 25 o C przez 48 godz. 4.2 Testy potwierdzające dla L. monocytogenes Test na hemolizę Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże agar z krwią, wykonując jednocześnie w przypadku każdej hodowli posiew kłuty w jednym miejscu. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 o C przez 24 godz. Test Camp Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże agar z krwią zgodnie ze schematem przedstawionym poniżej. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 o C przez 24 godz. S - Staphylococcus aureus ATCC R - Rhodococcus equi ATCC 6939 R S

4 Fermentacja ramnozy i ksylozy Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże płynne uzupełnione odpowiednim cukrem. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 o C przez 24 godz. Po przeprowadzeniu badania stwierdzić, czy w analizowanej próbce a) obecne były bakterie z rodzaju Listeria b) określić gatune II Metody molekularne 1.1. Izolacja DNA metodą lizy termicznej Pobrać kilka kolonii bakteryjnych z podłożu TSYEA i zawiesić w 20 l roztworu 0,25% SDS i 0,05 NaOH. Całość inkubować w 95 o C przez 15 minut, a następnie dodać 180 l zimnej redestylowanej jałowej wody. Zawiesinę wirować 3 minuty przy 13,4 obrotów/min. Supernatant jest źródłem totalnego DNA Określenie przynależności gatunkowej badanych szczepów Listeria spp. metodą PCR W celu określenia przynależności gatunkowej przeprowadzić reakcję amplifikacji DNA metodą PCR stosując odpowiednią parę starterów. Startery, amplifikowane fragmenty genów i wielkość powstających produktów przedstawiono w Tab. 1. Matrycą w reakcji amplifikacji jest DNA otrzymany metodą lizy termicznej. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 l, jej skład przedstawiono w Tab.2. Warunki reakcji amplifikacji: wstępna denaturacja: 95 o C, 4 min, 30 cykli: denaturacja - temp. 94 o C, 30 s; przyłączanie starterów - temp. 60 o C, 30 s; synteza DNA - temp 72 o C, 1 min. Ostatni etap reakcji: 7-minutową synteza w 72 o C w celu wypełnienia jednoniciowych końców zamplifikowanych fragmentów.

5 Tab.1 Starter Gatunek Produkt amlifikacjii genu Produkt (pz) LisI-F potencjalny regulator LisI-R? transkrypcji 453 LisII-F LisII-R LisIII-F? N-acetylomuramidaza 493 LisIII-R? iap 250 Tab.2 Składnik woda redestylowana bufor do polimerazy Ilość składnika na 1 x próbę 18.3 l 2,5 l Stężenie końcowe składnika mieszanina dntp 1 l 400 M odpowiedni starter F 1 l 400 nm odpowiedni starter R 1 l 400 nm polimeraza Taq 0.2 l 1 U matryca DNA 1 l Analiza produktów amplifikacji PCR Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Rozdział elektroforetyczny prowadzić w 1 % żelu agarozowych w buforze TAE przez 50 min przy napięciu 120 V. Na żel agarozowy nanieść po 10 l odpowiedniej próby, do której wcześniej dodano barwnik do elektroforezy. Po zakończeniu rozdziału żel wybarwić w wodnym roztworze bromku etydyny przez min i oglądać UV.